尼莫地平對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

夏樹(shù)前 龔樹(shù)生 李嬌 張富剛

內(nèi)耳動(dòng)脈似彈簧螺旋樣走行，血流經(jīng)過(guò)這種極端彎曲的血管后，一方面變得緩慢而平穩(wěn)，另一方面，彈簧樣結(jié)構(gòu)是保持局部血流自我調(diào)節(jié)穩(wěn)定的生理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，再加上血管路徑較長(zhǎng)，易發(fā)生血流淤滯和脂質(zhì)沉積，故易發(fā)生阻塞。疑為缺血引起的內(nèi)耳病變，經(jīng)顳骨解剖觀察，僅少數(shù)出現(xiàn)完全動(dòng)脈阻塞的病理變化，可能為一過(guò)性內(nèi)耳血流受阻后又部分或完全恢復(fù)，即發(fā)生了缺血再灌注。組織器官缺血再灌注損傷中均發(fā)現(xiàn)有鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞鈣超載，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抑制鈣離子內(nèi)流以期抑制細(xì)胞凋亡是目前研究的熱點(diǎn)。尼莫地平作為鈣離子拮抗劑，在心腦等器官缺血再灌注損傷中具有良好的保護(hù)作用，本研究旨在探討尼莫地平對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取42只豚鼠，雌雄不拘，隨機(jī)分為：實(shí)驗(yàn)組18只，尼莫地平干預(yù)組18只，對(duì)照組6只。實(shí)驗(yàn)組與干預(yù)組按ABR檢測(cè)時(shí)間及斷頭取聽(tīng)泡時(shí)間又分為再灌注1、2和6 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每一時(shí)間點(diǎn)6只豚鼠。對(duì)照組6只豚鼠不造模，作為空白對(duì)照。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 激光多普勒血流量?jī)x(Periflux System 5000,Perimed,瑞典)，視窗版perisoft軟件分析數(shù)據(jù)，ABR檢測(cè)儀(Bio-logic Systems 美國(guó))。FeCl3(三氯化鐵，天津化學(xué)試劑三廠)，分析純，配成40%水溶液；尼莫地平(德國(guó)拜耳股份有限公司)，用量為0.5 mg/kg。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1缺血再灌注模型的制備 實(shí)驗(yàn)組與干預(yù)組豚鼠腹腔注射6%水合氯醛0.6 ml/100 g，麻醉后動(dòng)物仰臥于手術(shù)臺(tái)，頭架固定頭部，頸前正中氣管切開(kāi)，插管，自主呼吸。自氣管旁進(jìn)路，分離附著于顱底的肌肉組織，暴露枕部顱底，于右側(cè)顱底用電鉆磨開(kāi)一約2 mm×4 mm骨窗，刺破硬、軟腦膜，暴露小腦前下動(dòng)脈。將浸有5 μl 40%FeCl3的濾紙覆蓋于小腦前下動(dòng)脈上，5分鐘后撤除濾紙，生理鹽水沖洗局部。連續(xù)記錄耳蝸血流量(cochlear blood flow,COBF)變化，30分鐘后COBF不再下降并穩(wěn)定，標(biāo)志血栓形成。干預(yù)組在應(yīng)用FeCl310分鐘前經(jīng)頸外靜脈注射尼莫地平0.5 mg/kg,實(shí)驗(yàn)組注射等量生理鹽水，正常對(duì)照組不注射任何藥物。小腦前下動(dòng)脈血栓形成后，生理鹽水稀釋尿激酶至1×104U/ml,干預(yù)組和實(shí)驗(yàn)組于頸外靜脈給予尿激酶4 000 U/kg緩慢推注，30分鐘后COBF不再上升且穩(wěn)定，標(biāo)志血栓溶解、血流再灌注。

1.3.2耳蝸血流量測(cè)量方法 打開(kāi)右側(cè)聽(tīng)泡，暴露耳蝸，三維固定儀固定激光多普勒流量?jī)x探針型探頭，使探頭尖端輕輕接觸耳蝸底回外側(cè)壁，測(cè)量耳蝸血流，穩(wěn)定三分鐘后連續(xù)記錄，結(jié)果以PSW軟件分析數(shù)據(jù)輸出。

1.3.3ABR檢測(cè)方法 干預(yù)組和實(shí)驗(yàn)組分別在缺血前、再灌注1、2、6 h時(shí)行ABR檢測(cè)，對(duì)照組行一次ABR檢測(cè)。同上法麻醉豚鼠，電極皆用直徑0.38 mm、長(zhǎng)13 mm的針灸針，記錄電極置于雙側(cè)耳廓前緣連線中點(diǎn)的頭頂皮下，參考電極置于同側(cè)耳垂皮下，鼻尖部接地。刺激聲為click,升降時(shí)間1 ms，平臺(tái)期10 ms，交替波，帶寬為100～1 500 Hz,刺激重復(fù)率為11次/秒，平均疊加300次，掃描時(shí)間10 ms,間期100 μs,聲刺激強(qiáng)度以120 dB SPL開(kāi)始，每10 dB一檔減至閾值上下，然后5 dB一檔升降確定閾值，以能引出明確的可重復(fù)波Ⅲ的最小刺激聲強(qiáng)度作為閾值。

1.3.4耳蝸基底膜鋪片及熒光染色 各組于ABR測(cè)試完畢后，斷頭取聽(tīng)泡，經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定1小時(shí)后，于10 mmol/L PBS(pH7.4)中分離基底膜，平鋪于玻片上，將濃度為10 μg/ml Hoechest33342 熒光染料 25 μl滴加在每一只標(biāo)本上，避光30分鐘，PBS沖洗三遍后，50%甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色觀察螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡因子Casepase-3變化 10%水合氯醛溶液腹腔注射30 mg/kg,仰臥固定，開(kāi)胸暴露心臟，灌流沖洗，隨后灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)500 ml。將豚鼠迅速斷頭，快速取出耳蝸，在蝸?lái)斻@孔并挑破圓窗膜和卵圓窗，用上述固定液重復(fù)進(jìn)行耳蝸灌流至少5 次后，放入相同固定液中，4 ℃過(guò)夜。修剪后置入10%乙二胺四乙酸二鈉充分脫鈣3周左右,梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，耳蝸中軸5 μm連續(xù)切片。Caspase-3免疫組化染色：耳蝸組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2孵育10 min，蒸餾水沖洗。滴加抗原修復(fù)液1～3滴，孵育10 min，，蒸餾水沖洗。10%正常羊血清封閉20 min；實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組滴加兔多抗Caspase-3抗體(1：200),4 ℃過(guò)夜，對(duì)照組用正常羊血清代替一抗；加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min；PBS漂洗三次，滴加鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)反應(yīng)液1～2滴，37 ℃二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色； Mayer蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明、封片，顯微鏡(10×40)視野觀察照相。以上試劑均由北京中山公司提供。

1.3.6圖像分析處理 Caspase-3染色切片由新9．0版HPIAS-100高清晰度彩色病理圖像免疫組化測(cè)量系統(tǒng)，在40倍視野下，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，測(cè)量每組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的平均吸光度。各組動(dòng)物于400倍光鏡下在耳蝸底回末段和第二回起始段分別取三個(gè)視野計(jì)數(shù)缺損內(nèi)毛細(xì)胞(缺失和損傷細(xì)胞)，并計(jì)算內(nèi)毛細(xì)胞缺損率(缺失加損傷細(xì)胞核與原有細(xì)胞核的比例)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)包處理。采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1耳蝸血流量監(jiān)測(cè) 各組耳蝸血流量見(jiàn)表1，可見(jiàn)，栓塞30分鐘時(shí)實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組耳蝸血流量較各組缺血前及對(duì)照組明顯降低，再灌注后耳蝸血流量又有所回升，但仍較缺血前低，說(shuō)明造模成功。耳蝸缺血再灌注前后，實(shí)驗(yàn)組與干預(yù)組耳蝸血流量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2ABR檢測(cè)結(jié)果 各組ABR閾值變化見(jiàn)表2，可見(jiàn)，缺血前實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組、對(duì)照組的ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，再灌注后干預(yù)組ABR閾值較實(shí)驗(yàn)組明顯降低(P<0.01)，較對(duì)照組和缺血前仍明顯升高(P<0.01)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)耳蝸血流量

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)ABR閾值

注：*與缺血前及實(shí)驗(yàn)組同時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.01

2.3耳蝸基底膜鋪片及熒光染色 對(duì)照組各回均有整齊排列的三排外毛細(xì)胞和一排內(nèi)毛細(xì)胞，毛細(xì)胞無(wú)缺失，實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組外毛細(xì)胞未見(jiàn)明顯的細(xì)胞核形態(tài)異常，內(nèi)毛細(xì)胞均有不同程度的丟失及細(xì)胞核形態(tài)異常，各回基底膜中內(nèi)毛細(xì)胞的損傷以底回為最，其次為第二回(圖1)。各組各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)毛細(xì)胞缺損率見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)組與干預(yù)組在同一時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Casepase-3免疫組化染色 實(shí)驗(yàn)組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有染色程度不同的棕黃色顆粒分布，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，以再灌注6 h最多，干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)SGC有少量細(xì)胞質(zhì)棕黃色顆粒分布，表達(dá)趨勢(shì)同實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組染色陰性(圖2)。圖像分析各組平均吸光度值見(jiàn)表3，干預(yù)組和實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)毛細(xì)胞缺損率和耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase-3平均吸光度值

注：*與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01

3 討論

內(nèi)耳缺血或栓塞可影響內(nèi)耳的功能，自身免疫性疾病、感染、噪聲、耳毒性藥物等也可引起內(nèi)耳缺血或缺血再灌注，從而引起內(nèi)耳毛細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致耳聾或眩暈。

耳蝸由基底動(dòng)脈的分支小腦前下動(dòng)脈供血，小腦前下動(dòng)脈屬于終末動(dòng)脈，無(wú)側(cè)枝循環(huán)，發(fā)生阻塞時(shí)，不能由其他動(dòng)脈的供血加以補(bǔ)償，因而易造成耳蝸缺血。相對(duì)于部分研究者[1]通過(guò)栓塞雙側(cè)椎動(dòng)脈，以微動(dòng)脈夾鉗夾—松開(kāi)一側(cè)頸總動(dòng)脈來(lái)完成耳蝸缺血再灌注的造模方法， 本實(shí)驗(yàn)用FeCl3誘導(dǎo)小腦前下動(dòng)脈血栓形成，以尿激酶溶解，更符合生理實(shí)際，并通過(guò)激光多普勒檢測(cè)耳蝸血流的變化，客觀地反映了耳蝸缺血再灌注變化過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用FeCl330分鐘時(shí)，耳蝸血流量顯著降低；再灌注1 h后，耳蝸血流量有所回升，動(dòng)物ABR反應(yīng)閾急劇升高，表明造模成功、可靠。

DNA熒光染料(PI或Hoechest33342)是一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的方法，可用于定量檢測(cè)壞死和凋亡的毛細(xì)胞[2]。而Casepase-3是casepase家族中重要一員，一般認(rèn)為它是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的終末剪切酶，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[3]，它的出現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)胞凋亡。因此，本試驗(yàn)選取DNA熒光染料染色和Casepase-3免疫組化法分別觀察耳蝸缺血再灌注過(guò)程中毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞核幾乎無(wú)形態(tài)學(xué)上的變化，部分內(nèi)毛細(xì)胞核固縮、缺失。Taniquchi[4]通過(guò)對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耳蝸缺血再灌注30 min后即有內(nèi)毛細(xì)胞核固縮，再灌注1 h即有核缺失，并且在24 h之內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)缺失率上升，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究實(shí)驗(yàn)組缺血再灌注1、2、6 h螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均有大量Casepase-3表達(dá)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明在耳蝸缺血再灌注條件下，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)促凋亡因素極為活躍，說(shuō)明耳蝸缺血再灌注早期，內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 各組耳蝸毛細(xì)胞核Hochest33342染色 a、b、c分別為實(shí)驗(yàn)組再灌注后1、2、6 h毛細(xì)胞核Hochest33342染色，d、e、f分別為對(duì)干預(yù)組再灌注后1、2、6 h毛細(xì)胞核 Hochest33342染色；g為正常對(duì)照組。 ★表示細(xì)胞核缺失，(→)表示細(xì)胞受損(細(xì)胞核固縮)。(共聚焦顯微鏡×400)

圖2 各組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 a、b、c為實(shí)驗(yàn)組1、2、6 h螺旋神經(jīng)節(jié)Caspase-3免疫組織化學(xué)染色，d、e、f為干預(yù)組1、2、6 h，g為正常對(duì)照組。箭頭表示Caspase-3免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞(SABC×400)

關(guān)于耳蝸缺血再灌注的損傷機(jī)制，目前尚無(wú)定論。研究表明，耳蝸Cort器、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中存在親離子谷氨酸受體AMPA(α-氨基羥甲基惡唑丙酸)，Corti器中AMPA受體位于內(nèi)毛細(xì)胞和傳入神經(jīng)樹(shù)突之間的軸突上，缺血再灌注后，刺激耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞和鄰近的支持細(xì)胞釋放大量的谷氨酸，激活A(yù)MPA受體，引起內(nèi)毛細(xì)胞鈣離子內(nèi)流[5～7]。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞除存在AMPA受體外，還存在ryanodine受體及 ryanodine受體門控的鈣池，這種鈣池有助于與聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)通路有關(guān)的鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)[8]，缺血時(shí)，內(nèi)流的鈣離子激活ryanodine受體，導(dǎo)致鈣池鈣離子釋放[9]。另外，耳蝸缺血再灌注還可引起細(xì)胞膜鈣離子ATP酶(PMCA)失活，不能有效地泵出鈣離子[10]。通過(guò)上述機(jī)制，最終引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

以往使用尼莫地平對(duì)心腦等器官缺血再灌注的研究表明，尼莫地平對(duì)缺血再灌注的作用為：①抑制鈣離子內(nèi)流，減輕線粒體鈣超載，抑制線粒體氧化磷酸化藕聯(lián)，從而恢復(fù)ATP生成[11]；②減輕細(xì)胞內(nèi)乳酸酸中毒：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH值下降和鈣積聚時(shí)，細(xì)胞通過(guò)鈉—?dú)浔煤外c—鈣交換排出鈣離子，因鈣離子內(nèi)流被抑制，使鈉-鈣交換減少，鈉—?dú)浣粨Q相對(duì)增加，而排出更多氫離子；而對(duì)線粒體功能的保護(hù)亦抑制了乳酸的生成[12]。Schnee等[13]研究離體耳蝸外毛細(xì)胞鈣離子電流時(shí)發(fā)現(xiàn)，尼莫地平可部分阻斷海龜耳蝸毛細(xì)胞電壓依賴性鈣電流，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子負(fù)荷，其抑制率與尼莫地平濃度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)干預(yù)組使用尼莫地平后，內(nèi)毛細(xì)胞缺失減少，螺旋神經(jīng)節(jié)Casepase-3表達(dá)下調(diào)，ABR反應(yīng)閾較實(shí)驗(yàn)組明顯降低，表明作為一種L型電壓門控性鈣通道阻滯劑，尼莫地平可能通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流從而直接或間接抑制促凋亡基因的表達(dá)，最終對(duì)缺血再灌注后的耳蝸起到有效的保護(hù)作用。

鈣通道阻滯劑尼莫地平作為降壓和擴(kuò)管藥物，應(yīng)用于心腦血管疾病方面取得了良好的療效，目前在耳科應(yīng)用方面，大部分人仍然把它作為改善內(nèi)耳血供的藥物使用。但有學(xué)者[14]在豚鼠耳蝸缺血后使用尼莫地平，發(fā)現(xiàn)其并不能改善耳蝸血流，據(jù)此認(rèn)為內(nèi)耳缺血時(shí)不宜使用尼莫地平。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)尼莫地平無(wú)法有效的增加耳蝸血流，但并不能由此否定其對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。另外，尼莫地平的濃度可能也是一個(gè)關(guān)鍵因素，有報(bào)道一定量尼莫地平會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而加重缺血再灌注時(shí)耳蝸細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)所用尼莫地平的濃度參閱多篇文獻(xiàn)，并在預(yù)試驗(yàn)中反復(fù)試驗(yàn)，確保了作為保護(hù)劑的合理濃度。至于尼莫地平干預(yù)組與正常對(duì)照組ABR反應(yīng)閾之間仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明尼莫地平還不能對(duì)缺血再灌注損傷起到完全預(yù)防保護(hù)作用，其機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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