MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中的表達及作用

周宏 周維镕 徐普慶

近年來國內外學者對中耳膽脂瘤引起的骨質破壞機制進行了大量研究,并提出許多理論，如: 膽脂瘤的機械壓力作用、慢性感染引起骨髓炎、pH值改變、破骨細胞的骨溶解作用、酶類介導的骨吸收作用、細胞因子參與的骨質破壞作用等[1]，盡管中耳膽脂瘤骨質破壞的確切病因尚未清楚,但關于中耳膽脂瘤骨質破壞吸收的機制主要有兩種學說[2], 即“機械壓迫學說”和“生物化學學說”。前者認為中耳膽脂瘤骨吸收主要是由于中耳膽脂瘤上皮細胞的過度增殖和凋亡引發角化上皮脫落加速，使膽脂瘤不斷增大，通過對周圍骨質的機械壓迫而使骨質吸收和破壞；研究發現[3]中耳膽脂瘤上皮細胞表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)蛋白的高比例存在，且不同膽脂瘤上皮以及同一膽脂瘤上皮的不同區域具有表達的不均一性，提示EGFR與不同的增殖活性有關。而后者指出在中耳膽脂瘤組織中存在大量酶, 它們對骨質的破壞起著重要作用；有實驗[4]表明基質金屬蛋白酶-9(human middle ear cholesteatoma，MMP-9)與中耳膽脂瘤的骨質破壞作用關系密切,是中耳膽脂瘤致骨質破壞的重要物質。因此，本研究擬通過檢測MMP-9、EGFR在中耳膽脂瘤中的分布及表達水平, 觀察二者與骨質破壞程度的相互關系, 進一步探討中耳膽脂瘤骨質破壞的可能機制。

1 資料與方法

1.1研究對象 中耳膽脂瘤組織和耳道深部正常皮膚均取自2008～2009年南通大學附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科收治的中耳膽脂瘤患者的手術標本, 共22例，年齡5～65歲, 男女之比為13∶9。每例均取一塊典型的中耳膽脂瘤上皮組織，并取一塊外耳道深部正常皮膚作對照。中耳肉芽組織取自2008～2009年南通大學附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科收治的伴肉芽增生的慢性化膿性中耳炎患者的手術標本，共10例, 年齡13～67歲,男女之比為3∶7。標本于手術中取出后經有經驗的病理科醫生檢查證實診斷無誤。

1.2研究方法

1.2.1標本染色 采用LAB VISION 2D全自動免疫組化染色儀，ELIVISON二步法進行染色。標本經4%福爾馬林固定、LEICA自動脫水、透明、浸蠟處理，包埋成蠟塊，切片厚度4～5 μm，將載玻片排列整齊烘干, 經POLY-L防脫片處理。置于溫度67 ℃烘箱中烘片2小時，脫蠟至水，PBS沖洗，分別按照MMP-9和EGFR一抗的要求進行預處理。處理完畢后放入自動免疫組化染色儀中，編程，從自動免疫組化染色儀中取出已染色完畢的切片，蘇木素復染，0.1%HCl分化, 自來水沖洗, 藍化, 切片經梯度酒精脫水干燥, 二甲苯透明,中性樹膠封固。

1.2.2結果判定

1.2.2.1MMP-9和EGFR的分布及表達水平判定 中耳膽脂瘤上皮組織和中耳肉芽組織、耳道深部正常皮膚的細胞膜或細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞，根據染色強度分為弱陽性(淡黃色)、中等陽性(棕色)、強陽性(棕褐色)。采用多媒體彩色免疫組化病理圖像分析系統對染色結果進行定量分析。每張切片于200倍視野下隨機計數4個視野，計算陽性表達率及平均光密度(A值)，取其均值為該標本測量結果。

1.2.2.2中耳膽脂瘤侵襲能力評定[5]術中觀察中耳膽脂瘤病變范圍及聽小骨破壞情況, 無明顯聽小骨破壞者記為(+), 破壞砧骨者記為(++), 破壞砧骨和錘骨者記為(+++ ), 破壞砧骨、錘骨、乳突天蓋和/或乙狀竇骨板者記為(++++)。

1.3統計學方法 應用計算機統計軟件Stata 7.0進行數據處理和分析,其中MMP-9或EGFR的各組標本之間及兩者之間差異性檢驗采用單因素方差分析，兩者之間相關性分析采用Pearson Correlation法,顯著性水準α= 0.05。

2 結果

2.1MMP-9和EGFR陽性細胞的表達 18例中耳膽脂瘤上皮、4例中耳肉芽組織和10例外耳道上皮組織中，MMP-9和EGFR呈陽性染色，在中耳膽脂瘤上皮染色最強, 多為中等至強陽性表達, 上皮組織各層細胞均有表達, 基底膜染色較強, 兩者的表達分布相同, 但從表達程度上看, MMP-9的表達稍強于EGFR(圖1～3)。在中耳肉芽組織及外耳道皮膚中MMP-9和EGFR均有不同程度的表達, 染色多為弱陽性。統計分析顯示各組之間差異有統計學意義(P<0.05)，中耳膽脂瘤組織中MMP-9和EGFR的陽性表達之間差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

2.2MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中的表達與骨質破壞的關系 本組中耳膽脂瘤侵襲能力評定(+)1例,(++)4例,(+++)10例，(++++)7例。 MMP-9和EGFR在(+-++)、(+++)、(++++)各級中耳膽脂瘤的平均A值(M)分別為0.24、0.26、0. 30和0.22、0.24、0.27,各級的平均A值之間差異有統計學意義(均為P<0.05), 進一步作兩兩比較發現不同級別之間差異均有統計學意義(兩兩組間比較均為P<0.05)。

表1 中耳膽脂瘤組織、肉芽組織、外耳道深部正常皮膚中MMP-9和EGFR的陽性表達

注：*與同一標本中MMP-9的表達相比較，P<0.05

圖1 中耳膽脂瘤上皮MMP-9陽性表達(免疫組化染色×200) 全層細胞強陽性圖2 中耳膽脂瘤上皮EGFR陽性表達(免疫組化染色×200) 全層細胞強陽性圖3 中耳膽脂瘤上皮MMP-9、EGFR陽性表達(免疫組化染色×200) 全層細胞強陰性

2.3MMP-9和EGFR表達的相互關系 MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中表達均為陽性15例,均為陰性3例, MMP-9和EGFR之間有相關性(r=0.488,P<0.05); 經Pearson相關分析顯示, 15例MMP-9、EGFR表達均陽性的中耳膽脂瘤中, 二者的平均A值之間存在相關性(P<0.05) 。

3 討論

中耳膽脂瘤形成的確切機制目前尚不清楚, 其危害主要決定于其對周圍骨質的破壞程度, 因此了解其骨質破壞的發生機制對于阻斷疾病的發展及減少并發癥的發生、防止復發是至關重要的。MMP-9是MMPs分子量最大的酶，是引起基底膜及細胞外基質降解的重要成分，它以酶原形式分泌, 被激活后形成Ⅳ型膠原酶, 直接參與生理和病理性溶骨過程[6]。研究表明, 表皮生長因子(EGF)能促進成纖維細胞、血管內皮細胞增生, 增強單核巨噬細胞的趨化和吞噬功能。增多的成纖維細胞在TNF -α等作用下又可合成和分泌多種生物活性酶, 如膠原酶、前列腺素E2等，這些介質可引起組織脫鈣、骨質和骨蛋白的溶解, 導致骨質吸收[7]。

本實驗結果顯示: MMP-9和EGFR在中耳膽脂瘤中的表達陽性率及平均A值明顯高于中耳肉芽組織、外耳道深部正常皮膚組織,且二者的表達與骨質的破壞程度相關，破壞范圍越廣，二者在中耳膽脂瘤中的表達越明顯。說明MMP-9和EGFR與中耳膽脂瘤的骨質破壞作用關系密切, 它們是中耳膽脂瘤骨質破壞中的重要物質，與李詠玲[8]的觀點一致。本研究還發現，MMP-9在中耳膽脂瘤中的表達陽性率及平均A值高于EGFR，推測MMP-9在膽脂瘤的骨質破壞作用中可能起了更主要的作用，MMP-9可能直接作用于周圍組織及骨基質, 起到骨質破壞作用。另外，本實驗結果還表明兩種蛋白陽性表達率之間及平均A值之間有相關性, 后者可能是前者產生的誘導因素,提示MMP-9可在炎癥刺激下,由膽脂瘤上皮組織中的細胞分泌的EGFR等細胞因子誘導產生[2,9]。二者之間的相互作用進一步加重骨質破壞,共同促進中耳膽脂瘤的發展, 在膽脂瘤的骨質破壞中起著關鍵的作用。

4 參考文獻

1 林刃輿，遲放魯.中耳膽脂瘤形成機理的研究進展[J]. 國外醫學耳鼻咽喉科學分冊，2001，25: 153、212.

2 徐志文, 倪海峰. 膽脂瘤型中耳炎骨質破壞機制及手術治療[J]. 國外醫學耳鼻咽喉科學分冊, 2005，29: 251.

3 李厚恩, 江平, 汪磊. 膽脂瘤上皮過度增殖行為的免疫組化研究[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2002，37:118.

4 葉放蕾,朱麗雅,崔艷紅，等. MMP-9在中耳膽脂瘤中的表達和意義[J].聽力學及言語疾病雜志,2008，16: 412.

5 江超武，展鴻謀,王文惠，等. 轉化生長因子β1和即刻早期基因及p27在中耳膽脂瘤上皮中的表達[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志，2004,39:211.

6 Fang J, Shing Y, Wiederschain D, et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 97:3 884.

7 孫文忠,徐志文,唐安洲，等.膽脂瘤上皮細胞增殖與凋亡的信息傳導及基因調控[J].國外醫學耳鼻咽喉科學分冊, 2005,29:131.

8 李詠玲.膽脂瘤型中耳炎的骨質破壞機制研究進展[J].醫學綜述，2008，14:1 054.

9 王輝兵，徐志文，唐安洲.膽脂瘤型中耳炎骨質破壞機制的組織酶學研究[J].耳鼻咽喉頭頸外科，2002，9：63.