雷公藤多苷對正常及佐劑關節炎大鼠睪丸組織形態結構、NOS表達影響的比較研究＊

李 健，譚 勇，呂永恒，何小鵑，鞠大宏，呂愛平△

(1.北京中醫藥大學基礎醫學院人體形態系，北京 100029;2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700;3.天津市南開理療醫院，天津 300100;4.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglycoside，GTW)是類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)臨床治療的“二線”首選藥物，但其明確的生殖毒性在很大程度上限制了該藥的臨床應用[1、2]。有中藥學專家指出，中藥的毒副作用是隨著機體狀態或疾病狀態而變化的。一些中藥可能對正常生理狀態的機體有毒副作用，而可能對病理狀態的機體沒有或僅出現輕微的毒副作用[3、4]。為了證明上述觀點，本研究以正常雄性SD大鼠(健康狀態)及弗氏完全佐劑誘導的類風濕性關節炎大鼠(發病狀態)為研究對象，比較觀察了GTW對2種不同機能狀態大鼠睪丸組織形態結構及NOS表達的影響，以期為針對中醫證候的中藥毒性評價思路提供客觀依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

大鼠NOS檢測試劑盒T-NOS(A014-2)購自南京建成生物工程研究所，雷公藤多苷片購自江蘇美通制藥有限公司(生產批號080717)，弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司，NOS一抗購自美國Santa Cruz生物公司(Sc-58399)，其他試劑及相關實驗耗材購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 動物及處置方法

雄性SD大鼠100只160g±20g，購于軍事醫學科學院，合格證號 SCXK-軍-2007-004。動物隨機分為正常組(40只)和AA組(60只)2組。AA大鼠的制備方法按照本課題組的常規方法進行[5]，2周后根據關節炎評分量表篩選得到病理特征明顯的AA大鼠40只組成AA發病組。正常及AA大鼠各自隨機分成4組(每組10只):溶劑對照組(生理鹽水)、GTW低劑量組(7mg/kg體重)、GTW中劑量組(70mg/kg體重)和 GTW高劑量組(105mg/kg體重)，灌胃給藥(1次/d，連續2周)。給藥劑量按人臨床常用量換算(大鼠系數為7)。

1.3 睪丸及附睪系數測定

準確稱量大鼠體重及睪丸、附睪的重量，計算臟器、體重的比值。

1.4 睪丸組織勻漿T-NOS測定

準確稱取大鼠睪丸組織，組織勻漿器勻漿，3000rpm離心10min，取上清，化學比色法測定上清中T-NOS的含量，具體實驗步驟參照試劑說明書。

1.5 睪丸組織石蠟切片HE染色

睪丸組織經4%多聚甲醛固定后行常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及 HE染色，光鏡觀察并攝片。

1.6 睪丸組織冰凍切片NOS免疫組化顯色

睪丸組織經OCT包埋、冰凍切片、S-P法免疫組化染色、DAB顯色、蘇木素輕度復染，光鏡觀察、攝片。

1.7 數據統計學分析

組內數據采用單因素方差分析，組間比較采用廣義線性模型兩因素方差分析，數據以均值±標準差表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AA大鼠模型的評價

AA模型制備的結果與本課題組前期實驗完全符合，具有高度重復性[5]。圖1顯示，佐劑注射1 d后，致炎側關節明顯紅腫，隨時間延長腫脹程度加劇;繼發側自佐劑注射后3周腫脹明顯并呈緩慢增高的趨勢，表明佐劑性關節炎模型制備成功。

圖1 弗氏完全佐劑誘導SD大鼠關節腫脹的變化趨勢(n=10)

2.2 GTW對睪丸及附睪系數的影響

各組大鼠體重及睪丸、附睪重量經精確稱量。圖2顯示，與溶劑對照組比較，GTW高劑量處理大鼠睪丸系數均呈顯著減小的趨勢(P<0.01)，而各組附睪系數沒有顯著性差異(P>0.05)。多元分析結果表明，正常組與AA發病組比較，睪丸及附睪系數均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 GTW對大鼠睪丸組織形態結構的影響

圖3顯示，正常組溶劑對照大鼠睪丸組織著色均勻，生精小管結構清晰，各級生精細胞排布規律，精子細胞及精子數量較多。與之比較，GTW低劑量處理大鼠睪丸組織沒有明顯的病理改變;GTW中、高劑量處理大鼠睪丸生精小管的生精上皮明顯變薄，細胞層次紊亂，部分生精細胞腫脹或空泡化，精子細胞及精子數量明顯減少。圖4顯示，與之比較，AA發病組中只有GTW高劑量處理大鼠睪丸組織出現較明顯病理改變外，其他各組大鼠睪丸組織形態結構均正常，沒有明顯的病理變化。

圖2 各組大鼠附睪系數(A)及睪丸系數(B)統計結果(n=10)

圖3 不同劑量GTW對正常大鼠睪丸組織形態結構的影響，HE染色，×100

圖4 不同劑量GTW對AA大鼠睪丸組織形態結構的影響(HE染色×100)

2.4 睪丸組織中T-NOS含量測定

與正常組溶劑對照大鼠比較，GTW高劑量處理大鼠睪丸組織中T-NOS含量顯著減少(P<0.05);與AA發病組溶劑對照大鼠比較，GTW低劑量處理大鼠睪丸組織中T-NOS含量顯著增加(P<0.05)。多元統計分析結果表明，AA發病組大鼠睪丸組織中T-NOS含量顯著高于正常組大鼠(P<0.05，圖5)。NOS抗體免疫組織化學顯色結果顯示:正常對照大鼠睪丸組織中NOS陽性反應明顯，陽性細胞較多(圖6-E);與之比較，GTW處理大鼠睪丸組織中NOS陽性反應減弱，陽性細胞減少(圖6-F)。AA發病組溶劑對照大鼠睪丸組織 NOS呈高表達(圖6-e);與之比較，GTW處理大鼠睪丸組織NOS亦呈強陽性(圖6-f)。

圖5 不同劑量GTW對正常大鼠及AA大鼠睪丸組織總NOS水平的影響(n=10)

圖6 睪丸組織冰凍切片pananti-NOS免疫組化(DAB顯色，×100)

3 討論

雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglycoside，GTW)中含有多種生物活性組分，如生物堿、二萜、三萜類等多種化學組分，具有祛風除濕、消腫、舒筋通絡等功效。上世紀80年代，雷公藤多苷被開發為中成藥(雷公藤多苷片)進入臨床，主要用于治療類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、原發或繼發性腎小球腎炎、哮喘等免疫相關性疾病。GTW治療RA的初步藥理機制是通過抗炎和免疫抑制作用，糾正T細胞亞群分布紊亂及多種炎癥介質釋放[1]。然而，GTW在臨床使用的過程中也伴隨著不同程度的毒副作用，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、肝功能異常及生殖毒性等[2]。動物實驗證實[6、7]，GTW能顯著抑制精子細胞及精子的形成，抑制睪丸組織中一氧化氮合酶(NOS)的合成，進而影響NO的生成和調控，導致精子發生受阻或發育停滯。為此，探討GTW毒副作用與機體病理生理狀態等因素的關系，了解其毒副作用形成的特點及規律是該藥臨床應用及二次開發的關鍵問題。

事實上，雷公藤抗男性生育的作用早為人知(計劃生育專家擬將其開發為男性避孕藥)，是該藥毒副作用研究不可回避的問題。本實驗比較觀察了高、中、低3個劑量GTW對正常生理狀態及佐劑誘導的關節炎病理狀態大鼠睪丸組織形態結構及NOS表達的影響。結果表明，GTW對2組大鼠的睪丸及附睪系數沒有影響。GTW低劑量(臨床等效劑量)對2組動物睪丸組織形態結構均無顯著影響;GTW中劑量(約臨床用量10倍)可導致正常大鼠睪丸組織生精上皮細胞層次紊亂和細胞腫脹，然而該劑量對關節炎發病狀態大鼠睪丸組織形態結構并無明顯影響。若用高劑量(約臨床用量的15倍)處理動物，正常及AA發病組大鼠睪丸組織形態結構均有明顯改變，生精小管萎縮、生精上皮變薄、精子細胞及精子數量減少。組織病理學結果提示，超高劑量GTW具有明顯睪丸毒性，而在一定劑量范圍內，正常大鼠表現出一定程度的睪丸毒性，而AA發病狀態大鼠睪丸毒性相對輕微。已有研究發現，睪丸組織中NO的含量與雄激素分泌關系密切，并對精子成熟、獲能、運動等生殖功能發揮調控作用[8、9]。NO是由NOS在NADPH-II作用下催化 L-精氨酸而產生的，組織中NOS的水平及活性可間接反應NO的含量。基于此，本實驗檢測了2組大鼠睪丸組織中總NOS的水平。多因素方差分析結果顯示，與正常組比較，關節炎發病組大鼠睪丸組織中NOS的水平相對較高，且差異顯著。NOS抗體免疫組化顯色結果驗證了上述結論，即GTW可能抑制了正常大鼠睪丸組織中NOS的表達，從而影響精子細胞及精子的生成。該結果提示，動物在健康態及AA發病態GTW的睪丸毒性存在顯著差異。綜上，一方面GTW的睪丸毒性與劑量相關:臨床等效劑量不存在睪丸毒性，較大劑量可誘發睪丸毒性;另一方面，GTW的睪丸毒性與機體生理狀態相關:與正常組比較，相同劑量GTW在AA發病大鼠體內產生的睪丸毒性相對較弱。

目前，對雷公藤毒性及毒理學的研究報道已有很多，但大多襲用了現代毒理學的研究思路和方法，所獲得的數據多來自于正常動物，所研究的是藥物對正常機體的毒性作用，缺乏中醫藥的自身特色[10]。眾所周知，中藥須在中醫藥理論指導下的使用，臨床應用過程中具有辨證用藥、配伍解毒、中病即止的特點[11]。《素問·六元正紀大論》有:“婦人重身，毒之何如……有故無殞，亦無殞也”的記載。文中雖然表面上討論的是妊娠期用藥問題，但實質闡述的是中醫對中藥藥性與毒性關系的認識，強調了“藥-證”密不可分的道理。古代醫家把中藥的“毒性”及機體的“不健康狀態”理解為“偏性”。中藥的治療原理在于“以偏糾偏”，當藥物糾“偏”時表現為治療效應，而當機體無“偏”時則表現為毒性。上世紀90年代，日本發生了小柴胡湯濫用引發間質性肺炎的事件就是“有故無殞”理論的典型例證[3]。

誠然，中藥毒理機制十分復雜，與機體代謝過程、生理狀態、作用靶點等密切關聯。但要真正揭示中藥毒理機制需借助功能基因組學、蛋白組學及代謝組學等技術手段，并結合系統生物學、網絡生物學等先進的數據分析方法。本課題組目前正在開展證候動物模型，以及附子、雷公藤等有毒中藥對不同證候、不同生理狀態動物生物標志物(biomarker)、代謝輪廓(metabolic profile)影響的研究，期望獲得更有說服力的實驗數據，為適合中醫藥特點的“中藥毒理學”研究提供現代醫學及生物學的證據及思路。

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