熒光光譜法研究橙皮甙與牛血清白蛋白的相互作用*

尚永輝 孫家娟 劉 靜 耿 薇

(咸陽師范學院化學與化工學院，咸陽 712000)

藥物進入人體后首先與血清白蛋白結合,通過血漿的存儲和運輸,到達受體部位產生藥理作用[1]。通過測定血清白蛋白的變化,可為疾病診斷、療效觀察等提供有價值的資料及數據。熒光光譜法是目前研究蛋白質與藥物分子相互作用的重要手段之一。

橙皮甙(Hesperidinum)屬黃酮類化合物，具有抗炎，抗病毒以及降低毛細血管脆性，防止微血管破裂出血等多種功效，是目前治療高血壓和心肌梗塞的常用藥物之一。實驗在pH 7.40的Tris-HCl緩沖介質中運用熒光光譜技術研究了橙皮甙與BSA的相互作用，并對其作用機理進行了初步分析。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計：RF-5301型，日本島津公司；

電子分析天平：HA-180MF型，日本日立公司；

牛血清白蛋白(BSA)：Amresco.0930，分子量為65 000；

橙皮甙：對照品，中國藥品生物制品檢定所；

Tris-HCl緩沖溶液：pH 7.40；

Tris、HCl：分析純；

實驗用水為雙重蒸餾水；

以Tris-HCl緩沖溶液為溶劑分別配制濃度均為1.0×10-3mol/L的BSA標準溶液和橙皮甙標準溶液，兩種標準溶液均在0～4℃的冰箱中保存，實驗所需濃度由此稀釋而得。

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中依次加入Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL、1.0×10-3mol/L BSA溶液0.1 mL以及一定量橙皮甙溶液，采用雙重蒸餾水稀釋至刻線，搖勻，分別在295、303、310、315K 4個實驗溫度下恒溫1 h，采用1 cm石英比色皿，以285 nm為激發波長，繪制300～500 nm的熒光光譜和Δλ=60 nm，Δλ=15 nm的同步熒光光譜，測定中入射狹縫與出射狹縫寬度均為3 nm。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

按照1.2方法分別測定了實驗溫度下橙皮甙對BSA的熒光猝滅光譜(310 K的熒光光譜見圖1)。

cBSA=0.1×10-4 mol/L； c Hesperidinum 從1到16依次為0、0.2、……、2.8、3.0 μmol/L圖1 橙皮甙對BSA熒光光譜的影響(T=311K)

由圖1可知，隨著橙皮甙濃度的逐漸增加，BSA的熒光強度逐漸降低，這是由于蛋白質中存在的色氨酸和酪氨酸使其具有內源熒光，當固定BSA的量不斷增加橙皮甙的濃度時, 橙皮甙與BSA之間的相互作用導致BSA內源熒光強度有規律地猝滅。

2.2 熒光猝滅機理及猝滅常數的測定

引起BSA熒光猝滅的原因有動態猝滅和靜態猝滅。兩種過程均遵從Stern-Volmer方程[2]，隨溫度的升高動態猝滅常數逐漸增大，而靜態猝滅常數逐漸減小，由此可判斷熒光猝滅類型。

根據不同溫度下橙皮甙對BSA猝滅的Stern-Volmer曲線，可以得到不同溫度下橙皮甙對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數，數據列于表1。

表1 不同溫度下橙皮甙對BSA的猝滅常數

注：表中F0，F分別表示加入猝滅劑橙皮甙前后BSA的熒光強度，[Q]為猝滅劑橙皮甙濃度，Kq為猝滅常數。

隨溫度升高猝滅常數(Kq)逐漸增加，表明橙皮苷對BSA的猝滅過程應該是以動態猝滅為主。各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數約為2×1010L/(mol·s),而從表1結果來看,Kq均大于該值，由此考慮，猝滅過程應為靜態猝滅，但考慮到離子強度是影響猝滅系數的重要因素，實驗采用0.1 mol/L NaCl以控制溶液離子強度，筆者認為Kq的增大可能是離子強度影響的結果[3]。

2.3 牛血清白蛋白與橙皮甙結合反應的熱力學性質及作用力

根據文獻計算出310、315K溫度下橙皮甙與BSA作用的熱力學參數自由能變ΔG=-28.92 kJ/mol(310K)，ΔG=-27.34 kJ/mol(310K)，焓變ΔH=70.71 kJ/mol，熵變ΔS=316.29 J/mol，由ΔG<0得知橙皮甙與BSA的結合過程是自發進行的，根據Ross等[4]總結出的判斷生物大分子與小分子結合力性質的熱力學規律，ΔH>0和ΔS>0表明橙皮甙與BSA結合過程以疏水作用力為主。

2.4 橙皮甙與BSA的表觀結合常數Kb以及結合位點數n

當小分子與大分子結合時，其表觀結合常數Kb與結合位點數n由下式求出[5]:

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

在實驗溫度下繪制不同濃度的橙皮甙與BSA的lg[(F0-F)/F]～lg[Q]的雙對數圖，根據截距和斜率求得相應的Kb和n，結果見表2。

由表2可看出,結合位點數n接近1，表明橙皮甙與BSA可形成一個結合位點。橙皮甙與BSA的結合常數Kb值在104數量級以上,表明橙皮甙與BSA之間有較強的結合作用，可以被蛋白質運輸和儲存。

表2 橙皮甙與BSA的表觀結合常數Kb以及結合位點數n

2.5 同步熒光光譜

由于芳香氨基酸殘基的最大發射波長與其所處環境極性有關,可由發射波長的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環境的變化情況。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[4]。固定BSA濃度為1.0×10-5mol/L，逐漸改變橙皮甙濃度分別測定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜(圖略)，由圖可知，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光發射峰強度均隨橙皮甙濃度的增加而產生猝滅，酪氨酸殘基，色氨酸熒光發射峰的位置均無明顯移動,表明橙皮甙對蛋白質微環境構象的改變不大[6]。色氨酸熒光發射波長與BSA的熒光發射波長接近,且色氨酸殘基熒光猝滅程度比酪氨酸殘基更顯著，表明BSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻，結合位點更接近于色氨酸殘基。

3 結語

采用熒光光譜技術研究了橙皮甙與BSA的相互作用。結果表明：橙皮甙對BSA的熒光猝滅屬于動態猝滅過程。兩者之間的相互作用是靠疏水作用力相結合的一個自發過程，應用同步熒光光譜考察了橙皮甙對BSA構象的影響。

[1] Olson R E，Christ D D. Plasma protein binding of drugs[J]. Annu Rep Med Chem, 1996,31:327-336.

[2] Sun S F, Zhou B, Hou H N. Studies on the interaction between International Oxaprozin-E and bovine serum albumin by spectroscopic methods[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2006,39(4-5):197-200.

[3] 陳國珍,黃賢智,許金鉤, 等.熒光分析法[M].北京:科學出版社, 1990:502.

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[6] 杜秀蓮,李榮昌,王夔. 用同步熒光光譜法研究鋱(Ⅲ)與脫鐵運鐵蛋白的作用[J].科學通報, 2001,46(5):394-396.