液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物性食品中20種抗生素類藥物殘留

(鹽城市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，鹽城市 224005)

抗生素類藥物是一種應(yīng)用廣泛、種類泛多的藥物，已被應(yīng)用于可食性動物疾病的治療和藥物添加劑中，它是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)產(chǎn)生、能抑制或殺滅其它微生物的物質(zhì)。抗生素分為天然品和人工合成品，前者由微生物產(chǎn)生，后者是對天然抗生素進行結(jié)構(gòu)改造獲得的部分合成產(chǎn)品。隨著動物性食品需求的急劇增長, 由于抗生素類藥物的不合理使用和濫用、不遵守休藥期等多種原因所導(dǎo)致的動物性食品中藥物殘留問題不斷增多,對公眾健康的潛在危害日趨嚴(yán)重[1]。為此,國際食品法典委員會(CAC)[2]制定了動物組織及產(chǎn)品中獸藥殘留的最高殘留限量(maximum residue limits of veterinary drugs, MRLVDs )的規(guī)定, 用以保障公眾健康和各國正常進出口貿(mào)易。

目前，國內(nèi)外檢測抗生素類藥物殘留的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法[3-7]。由于氣相色譜法等其它方法具有局限性，如不能良好定性、樣品檢驗過程復(fù)雜、只能檢測單一品種、陽性結(jié)果還需驗證、樣品需衍生化等原因，近年來，液質(zhì)聯(lián)用法已成為檢測各種抗生素類藥物的主要檢測方法，特別是液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，由于其良好的適用性、定性定量功能及高靈敏度，已成為藥物殘留檢測的主要方法。近幾年，國內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)了利用液質(zhì)聯(lián)用法測定部分抗生素類藥物的報道，另外，我國相繼出臺了檢測動物源性食品中抗生素類藥物的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，但這些方法僅是針對單類抗生素的檢測[6,8]。

建立快速高效的多種抗生素類藥物檢測方法是食品安全檢測技術(shù)發(fā)展的一個重點，同時測定多種成分是實現(xiàn)系統(tǒng)、快速、高效檢測的重要手段之一。筆者以動物性食品中抗生素類藥物殘留為研究對象，采用液質(zhì)聯(lián)用法對動物性食品中β-內(nèi)酰胺類青霉素類抗生素(羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、萘夫西林、苯唑青霉素、青霉素V、芐青霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素 、交沙霉素、羅紅霉素、螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素)、四環(huán)族抗生素(金霉素、強力霉素、土霉素、四環(huán)素)和林可胺類(林可霉素)20抗生素藥物殘留進行分析研究。試驗結(jié)果表明，該方法操作簡單、快速，精密度、準(zhǔn)確度高，可同時檢測多種抗生素類藥物殘留。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent 6410型，美國安捷倫公司；

氮吹儀：HGC-12A型，天津市威儀科技發(fā)展有限公司；

去離子水發(fā)生器：Milli Q 型，美國Millipore公司；

勻漿機：FS-1型，江蘇金壇市榮華實驗儀器廠；

電子天平：CP225D型，0.01 mg，德國賽多利斯公司；

冷凍臺式高速離心機：美國Thermo公司；

旋渦混合器：SIR4型，德國IKA 公司；

多功能食品粉碎機：SG250A型，上海藝華電器廠；

水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；

固相萃取儀：HSE型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

20種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：均購自美國Sigma 或德國Dr. E公司, 純度不低于95%；

甲醇、乙腈：色譜純；

甲酸、乙酸、乙酸銨：分析純；

實驗用水為超純水；

固相萃取小柱：Waters Oasis HLB，規(guī)格為1 cc/30 mg(顆粒度30 μm)；

試樣：市售動物性食品。

1.2 儀器分析條件

(1)液相色譜條件

色譜柱: Agilent Eclipse plus C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm); 流動相: 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，流速為0.3 mL/min; 梯度: 0～0.5 min 5% B, 0.50～3.0 min 5%～20%B，3.0～8.0 min 20 %～35%B，8.0～12.0 min 35%～95% B，12.0～17.0 min 95%B，后運行時間(post time)為7 min;柱溫: 室溫; 進樣量: 10 μL 。

(2)質(zhì)譜條件

離子源: 電噴霧離子源； 掃描方式: 正離子掃描；檢測方式: MRM多重反應(yīng)檢測； 氣體溫度： 350℃;氣體流速： 10 mL/min;霧化器壓力：310.3 kPa (45 psi);毛細(xì)管電壓:3 500 V；時間分段數(shù)：0～8.5 min Time segment 1，8.5～17 min Time segment 2。

1.3 溶液配制

(1)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

分別精密稱取20種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇-水(體積比為95∶5)分別配制成1 g /L 的儲備液，于-18℃冰箱中保存。

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

依次吸取20種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用初始流動相(0.1%甲酸水溶液-乙腈，體積比95∶5)稀釋成濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

(3)磷酸鹽緩沖溶液

稱取67.7 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)和1.5 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，用水定容至1 000 mL，配制成0.2 mol/L pH 8的磷酸鹽緩沖溶液。

1.4 樣品前處理

(1)提取

準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL離心管中,加入磷酸鹽緩沖溶液20 mL，超聲提取10～20 min,提取兩次，以 8 000 r/min的速率在4℃下高速離心10 min，取5 mL上清液待過HLB固相萃取小柱。

(2)凈化

使用HLB固相萃取小柱前，先用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液活化，將1.4(1)制得的上清液過柱，棄去濾液，依次用2 mL磷酸鹽緩沖液、2 mL水淋洗去除雜質(zhì)，抽干2～5 min，最后用6 mL乙腈洗脫并接收；將洗脫液在45℃下以N2吹濃縮近干，用初始流動相(0.1%甲酸水溶液-乙腈，體積比95∶5)定容至1 mL，旋渦混合后過0.45 μm濾膜，濾液供HPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 MS-MS測定

根據(jù)歐盟EC657[9]指令的規(guī)定，對于液-質(zhì)聯(lián)用的方法，一個母離子(1.0 識別點)加兩個特征子離子(2×1.5識別點)可以滿足對一個被分析物4個識別點的定性確證的要求。表1 列出了20 種抗生素的母離子、子離子、保留時間、碎裂電壓及其碰撞能量參數(shù)。

表1 20 種抗生素的主要質(zhì)譜條件參數(shù)及色譜保留時間

續(xù)表1

化合物保留時間/min定性離子對(m/z)定量離子對(m/z)碎裂電壓/V碰撞能量/V螺旋霉素1)6.41843.5/174843.5/101843.5/1742002003846替米考星1)7.69869.5/696.4869.5/174.1869.5/174.12202204246泰樂菌素2)9.70916.5/174916.5/101916.5/1742202204050金霉素1)5.82479.1/462479.1/154479.1/4621301301430強力霉素1)7.06445.2/428445.2/321445.2/4281501501430土霉素15.12461.2/443.1461.2/426461.2/426120120614四環(huán)素1)5.40445.1/427445.1/410445.1/410125125614林可霉素1)4.43407.3/359.3407.3/126.2407.3/126.21401401429

注：1)Time segment 1; 2)Time segment 2。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

動物性食品基質(zhì)差異比較大，實驗中選取牛奶、蜂蜜、羊肉作為典型基質(zhì)進行加標(biāo)試驗。樣品提取中，對于動物性食品中抗生素類物質(zhì)殘留，提取方法主要為緩沖液提取，固相萃取凈化后再進樣分析。試驗比較了磷酸鹽緩沖溶液和Na2EDTA-Mcllvaine(0.1 mol/L,pH 4.0)緩沖溶液[8]的提取效果，結(jié)果顯示前者能較好地提取出各被測組分，而后者對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素提取效果較差，紅霉素的回收率低于40%，原因是酸性條件下一些大環(huán)內(nèi)酯藥物如紅霉素會分解[10]。

一般固相萃取柱的類型為反相的C18和HLB，或者陽離子交換的MCX和SCX柱。在使用陽離子交換時, 需要調(diào)節(jié)pH值至酸性。試驗中比較了HLB柱和MCX柱(BESEP HR-XC，60 mg/3 mL)兩種固相萃取柱的萃取效果。試驗結(jié)果顯示，HLB柱上, 所有的被測抗生素的回收率都在70%以上，而在陽離子交換柱MCX上, 紅霉素、替米考星幾乎沒有回收率, 泰樂菌素和螺旋霉素的回收率不到25%。因此實驗選用磷酸鹽緩沖溶液提取、HLB固相萃取柱凈化。

2.3 線性方程、檢出限和定量限

在選定的色譜條件下，對系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以目標(biāo)化合物峰面積(Y)和對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(X)進行線性回歸，得到20種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)。以信噪比(S/N)為3計算方法的檢出限(LOD)，以S/N為10計算方法的定量限(LOQ)，20種抗生素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果列于表2。混合標(biāo)樣總離子流圖圖1所示。圖1中各各組分的保留時間見表1。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

圖1 混合標(biāo)樣總離子流色譜圖

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

采用10、50、100 μg/mL 3個標(biāo)準(zhǔn)添加濃度，分別對牛奶、蜂蜜、羊肉樣品進行加標(biāo)回收試驗，試驗結(jié)果見表3。

表3 方法的回收率和精密度試驗結(jié)果(n=5) %

續(xù)表3

化合物基質(zhì)10μg/mL50μg/mL100μg/mL回收率RSD回收率RSD回收率RSD鄰氯青霉素牛奶蜂蜜羊肉93.487.3107.28.44.67.380.187.482.06.23.78.9103.890.4102.78.85.07.4雙氯青霉牛奶蜂蜜羊肉101.493.897.75.64.57.493.986.285.86.17.34.886.5105.7102.410.58.23.6萘夫西林牛奶蜂蜜羊肉106.290.597.35.78.36.786.290.191.37.89.36.290.087.091.24.811.19.2苯唑青霉素牛奶蜂蜜羊肉111.498.7104.89.47.18.198.297.191.04.25.68.588.4104.1103.96.95.19.2青霉素V牛奶蜂蜜羊肉105.689.795.35.34.76.385.787.286.45.31.311.8114.087.296.18.08.25.8芐青霉素牛奶蜂蜜羊肉107.899.790.89.85.67.290.783.992.94.29.97.7103.888.3109.84.99.311.7紅霉素牛奶蜂蜜羊肉97.698.4111.79.38.110.8106.087.683.88.66.18.379.198.6104.410.28.47.1交沙霉素牛奶蜂蜜羊肉100.894.887.64.25.96.981.797.187.610.15.29.284.7113.684.05.13.89.5羅紅霉素牛奶蜂蜜羊肉113.397.684.38.97.45.888.4108.091.94.39.311.3112.689.486.38.46.38.0螺旋霉素牛奶蜂蜜羊肉106.092.790.511.26.67.5101.395.985.45.78.08.6111.8116.091.911.09.66.9替米考星牛奶蜂蜜羊肉89.081.2112.810.89.111.793.2105.981.711.610.89.589.6112.778.27.25.910.1泰樂菌素牛奶蜂蜜羊肉102.090.886.66.18.14.897.196.095.36.66.910.293.9110.2105.48.53.19.8金霉素牛奶蜂蜜羊肉104.695.990.45.47.66.398.594.190.512.48.63.8106.886.891.62.79.24.1強力霉素牛奶蜂蜜羊肉94.2104.297.33.76.45.295.099.0114.65.44.99.3108.5114.191.55.09.71.1土霉素牛奶蜂蜜羊肉92.785.6104.82.85.46.587.785.197.38.12.75.696.9102.097.53.012.07.3四環(huán)素牛奶蜂蜜羊肉99.182.597.48.84.37.473.6105.392.57.16.25.582.491.6114.25.49.92.1林可霉素牛奶蜂蜜羊肉105.375.684.64.710.96.986.387.594.79.97.88.399.394.5105.13.75.64.3

由表3數(shù)據(jù)可知，本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，符合歐盟EC657[9]指令對殘留檢測方法的規(guī)定。加標(biāo)樣品中殘留物的特征離子豐度比與標(biāo)準(zhǔn)物的特征離子豐度比之間的偏差在20%以內(nèi)，滿足質(zhì)譜方法的確證要求。

3 結(jié)論

建立了動物性食品中β-內(nèi)酰胺類青霉素類抗生素(羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、鄰氯青霉素、雙氯青霉素、萘夫西林、苯唑青霉素、青霉素V、芐青霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(紅霉素 、交沙霉素、羅紅霉素、螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素)、四環(huán)族抗生素(金霉素、強力霉素、土霉素、四環(huán)素)和林可胺類(林可霉素)共20種抗生素藥物殘留的測定方法。對樣品的前處理條件、檢出限、方法的檢出限和準(zhǔn)確度等方法學(xué)參數(shù)進行了優(yōu)化和驗證，均得到了滿意的結(jié)果，能滿足日常分析檢驗的需要，提高了動物性食品多種類抗生素殘留檢測效率。

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