硫普羅寧與牛血清白蛋白相互作用的研究*

周能 周振

(玉林師范學院化學與生物系，天然產物研究所，玉林 537000)

硫普羅寧(Tiopronin)用于脂肪肝、早期肝硬化、急性、慢性、病毒性、酒精性及藥物性肝炎及重金屬中毒的治療。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，具有貯運內源代謝產物和外源藥物小分子等重要生理功能[1]。探討有機小分子與蛋白質等生物大分子的相互作用模式與特征一直是目前生物化學和醫學界共同關注和感興趣的課題。筆者應用熒光光譜法研究了在生理條件下(pH 7.4)不同溫度時，硫普羅寧與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，結果表明，硫普羅寧對BSA內源熒光的猝滅機制屬于動態猝滅與靜態猝滅相結合，計算了硫普羅寧與牛血清白蛋白之間的結合常數K，并根據熱力學參數確定了硫普羅寧與牛血清白蛋白之間的主要作用力類型為疏水作用力。同步熒光結果表明，硫普羅寧對BSA的構象沒有影響。此外，討論了共存金屬離子和甘草次酸對硫普羅寧與BSA結合作用的影響，為探討硫普羅寧在生物體內與蛋白質的作用機理和生物學效應提供了理論依據。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計：F-2500型，日本Hitachi公司；

雙光束紅外分光光度計：WGH-30/6型，天津市港東科技發展有限公司;

石英比色皿：1 cm；

微量注射器：上海高鴿工貿有限公司；

旋渦混合器：XH-C型，金壇市醫療儀器廠；

精密天平：CP324S型， 德國賽多利斯股份公司；

數字酸度計：pHS-3D型，上海雷磁儀器廠；

牛血清白蛋白(BSA)：電泳純，以水配成2×10-5mol/L的溶液，于4℃保存備用;

硫普羅寧：生化試劑，純度為99%,河南省新誼藥業股份有限公司,以水配成8×10-3mol/L的溶液；

三羥甲基氨基甲烷(Tris)固體：AR,加濃鹽酸配制成pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液；

甘草次酸:生化試劑,純度不小于97%，以90%甲醇配成8.0×10-4mol/L的溶液；

實驗用其它試劑均為分析純；

實驗用水為雙重蒸餾水。

1.2 實驗方法

(1)硫普羅寧與BSA作用

在10 mL容量瓶中依次加入2 mL 0.50 mol/L NaCl溶液(用于維持離子強度)、2 mL pH 7.40的Tris-HCl緩沖溶液、2 mL BSA溶液，以水定容為10 mL,搖勻,在一定溫度下靜置30 min。取該溶液1 mL于石英比色皿中，以微量注射器依次加入一定體積的硫普羅寧等藥物，旋渦混勻，測定不同溫度下硫普羅寧對BSA的熒光猝滅光譜強度,同時測定同步熒光。設定熒光激發與發射的狹縫為2.5/2.5 nm，光電倍增(PMT)設為700 V，在280 nm的激發波長下，掃描290～420 nm熒光光譜，結果為3次平行實驗的平均值。

(2)甘草次酸、金屬離子對硫普羅寧與BSA作用的影響

取BSA溶液1 mL于石英比色皿中，以微量注射器分別加入定量Mg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和甘草次酸(GA)溶液(加入體積小于3 μL),再以微量注射器依次加入一定體積(0、2.5、5、10、15、20、25、30 μL)的硫普羅寧等藥物，旋渦混勻，測定硫普羅寧對BSA的熒光猝滅光譜強度。

2 結果與討論

2.1 硫普羅寧對BSA的熒光猝滅作用

牛血清白蛋白中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基[2]，其相對強度之比為100∶9∶0.51[3]，所以蛋白具有內源熒光，其熒光主要來自色氨酸殘基，該殘基位于BSA的疏水腔內。當激發波長為280 nm時，通常認為蛋白質的色氨酸和酪氨酸產生熒光。

在濃度固定的BSA溶液中，依次加入不同體積(0、2.5、5、10、15、20、25、30 μL)的硫普羅寧溶液，按實驗方法測得硫普羅寧對BSA的熒光猝滅光譜見圖1。在此過程中,最大發射峰位于340 nm且保持不變。在激發波長為280 nm時，BSA的最大熒光發射波長為340 nm。在BSA溶液中，隨著硫普羅寧濃度的增加，BSA熒光發射峰強度有規律地降低，說明體系對BSA的內源熒光有猝滅作用。

圖1 硫普羅寧對BSA的熒光猝滅作用

2.2 熒光猝滅作用的Stern-Volmer分析

含色氨酸殘基的蛋白質的內源性熒光及其變化直接反映了蛋白質中色氨酸殘基本身和周圍的親水性和疏水性的變化。在有其它物質存在時，熒光給體的熒光強度降低的現象稱作熒光猝滅,如藥物存在情況下也會發生熒光猝滅。假設硫普羅寧對BSA熒光的猝滅是由于猝滅劑分子與BSA分子相互碰撞而引起的動態猝滅，式(1)為Stern-Volmer[4]方程：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

采集295K和299K溫度下硫普羅寧對BSA熒光猝滅光譜中340 nm處各曲線的熒光強度數據，并求出(F0-F)/F(F0和F分別為不加入和加入硫普羅寧時BSA的熒光強度)，經過線性擬合得圖2。由方程斜率求得猝滅速率常數為：T=295K，Ksv=4.79×102L/mol,Kq=4.79×1010L/(mol·s)；T=299K，Ksv=1.47×103L/mol,Kq=1.47×1011L/(mol·s)。結果顯示硫普羅寧對BSA的猝滅速率常數大于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散碰撞猝滅速率常數2.0×1010L/(mol·s)[5]，但與該值相差不大，考慮到猝滅常數隨溫度升高而升高，推斷硫普羅寧對BSA的猝滅是動態猝滅與靜態猝滅[6]相結合的結果。

圖2 硫普羅寧對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer分析

2.3 硫普羅寧與BSA的結合常數和結合位點數

藥物與血清蛋白存在的非共價作用，一般采用位點結合模型解釋。設硫普羅寧與BSA形成n個結合位點的復合物，且這種復合物無熒光，則可推導得求算結合常數和結合位點數n見式(2)：

(2)

在此，K表示某類結合位點的結合常數；n表示一個BSA中某類結合位點能夠結合的小分子數目，即結合位點數；[Q]表示游離小分子濃度，在研究中通常以其總濃度代替。

2.4 硫普羅寧與BSA的結合力

藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，不同藥物與牛血清白蛋白作用力類型不同。當溫度變化不大時，反應的焓變可以視作常數。根據Van′t Hoff熱力學方程[7][見(3)式和(4)式]可以計算出藥物小分子與生物大分子作用間的有關熱力學常數：

ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS

(3)

ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

(4)

ΔH、ΔG、ΔS分別表示焓、自由能和熵的變化。K為表觀結合常數，R為摩爾氣體常數。根據295K和299K兩個溫度下的結合常數可以計算出硫普羅寧與BSA相互作用的熱力學函數值，結果列于表1。

表1 硫普羅寧與BSA相互作用的相關熱力學參數

Ross等根據大量的實驗結果總結出判斷生物大分子與小分子結合性質的熱力學規律[2]，即ΔH>0，ΔS>0主要表現為疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0主要表現為氫鍵和范德華力；ΔH<0，ΔS>0主要表現為靜電作用力。據此可以判斷，硫普羅寧與BSA的結合是一個自發過程(ΔG<0)，而它與BSA結合的ΔH>0，ΔS>0，說明該體系中硫普羅寧與BSA之間的主要作用力是疏水作用；反應的ΔH>0，表明反應為吸熱反應。

2.5 同步熒光研究硫普羅寧對BSA構象的影響

同步熒光光譜可用來判斷發射團周圍環境的極性是否發生變化。激發和發射波長差是一個重要的參數。同步熒光光譜法可被用于蛋白質構象的分析，主要是基于Δλ的變化來加以考察[8]。蛋白質的熒光主要來自色氨酸、酪氨酸殘基，氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處環境的疏水性有關[9]。在同步熒光光譜中，根據Miller建議，激發波長和發射波長的差值(Δλ)不同，反映不同熒光團的光譜。當Δλ=15 nm時，所得同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的特征熒光；Δλ=60 nm時，所得同步熒光光譜只顯示色氨酸殘基的特征熒光[10]。而色氨酸、酪氨酸殘基的最大發射波長與其所處的微環境緊密相關，因此可以據此考察蛋白質構象變化情況。

固定BSA的濃度，逐漸增加硫普羅寧的濃度，繪制BSA的同步熒光光譜,分別為酪氨酸和色氨酸殘基的熒光光譜。結果表明,BSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻,且隨硫普羅寧濃度的增大,色氨酸和酪氨酸殘基的同步熒光光譜的最大波長分別為286 nm和280 nm,并保持不變,表明在研究的范圍內,硫普羅寧的加入沒有引起BSA的構象變化。而從熒光猝滅的幅度看,Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的熒光降幅分別為21.6%和26.0%，相差不大,說明硫普羅寧與BSA的作用可能為非特異結合。

2.6 甘草次酸和金屬離子對硫普羅寧與BSA結合的影響

從臨床醫學和藥學的角度考慮，若金屬離子的存在使藥物在血漿中的貯留時間相應延長，藥物釋放得更緩慢，藥效更持久。本實驗考察了一些常見金屬離子和治療乙肝的藥物甘利欣的體內代謝產物甘草次酸(GA)對硫普羅寧與BSA結合的影響，試驗在299K下進行，結果如表2所示。結果表明，在Mg2+、Mn2+、Cu2+存在的情況下，減小了藥物與蛋白質間的結合常數，Mn2+存在使得結合常數明顯減小；在Co2+、Zn2+、GA存在的情況下，卻增大了藥物與蛋白質間的結合常數，GA存在使得結合常數明顯增大。考慮到硫普羅寧與BSA結合常數很小，這些物質的共存不會對其藥效產生大的影響。

表2 金屬離子和GA對硫普羅寧與BSA結合常數的影響

注：K′表示有干擾的表觀結合常數值；K表示沒有干擾的表觀結合常數值。

3 結論

采用熒光技術研究了硫普羅寧與BSA之間結合作用,得到了反應的結合常數、結合熱力學性質和結合位點等參數。根據熱力學常數確定了該藥物與血清白蛋白之間的作用力類型，并探究金屬離子的介入對硫普羅寧與牛血清白蛋白的結合影響，結果將有助于深入了解硫普羅寧在動物體內結合、運輸、排泄和毒理。

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