水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產物檢測方法的探討

羅瑞峰 羅小玲 馬小寧

[農業部食品質量監督檢驗測試中心(石河子)，石河子 832000]

孔雀石綠(MG)和結晶紫(CV)是一種三苯甲烷類染料，極易溶于水，水溶液呈藍綠色。自1993年起孔雀石綠和結晶紫開始作為驅蟲劑、殺菌劑、防腐劑在水產養殖中出現，而后因為具有價格低廉、效果顯著等優點，被廣泛應用于預防與治療各類水產動物的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病等。但隨著研究的深入，孔雀石綠和結晶紫潛在的致癌、致畸、致突變等毒副作用[1]受到人們關注，人食用了殘留孔雀石綠和結晶紫的魚會對人體健康造成巨大威脅。

近幾年，人們對水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產物的研究非常活躍，關于檢測方法的報道文獻就有上百篇，國標、行業標準有4個[2-5]，基本原理是用乙腈-緩沖鹽混合液提取，再用二氯甲烷液-液萃取，固相提取小柱凈化，上儀器測定。但這幾種方法在實際操作時會出現一些困難，比如：(1)液-液萃取時乳化較為嚴重，無法分層；(2)二氯甲烷層具有忽上忽下的現象；(3)提取液濃縮時暴沸；(4)樣品處理液有分層現象；(5)上機標準溶液的定容介質和分析物的靈敏度有關。筆者對幾種檢測方法的前處理進行了比較，總結了這幾種標準檢測方法的優缺點，對其中的前處理方法進行適當優化，建立了快速篩選方法，同時探討了測定過程中應注意的一些問題。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695型，配Waters 2475熒光檢測儀，美國Waters公司；

超聲波清洗器：美國Waters公司；

漩渦振蕩器：XW-80A型，上海精科實業有限公司；

高速冷凍離心機：H2500R-2型，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：R-210型，上海博訊實業有限公司；

孔雀石綠標準品：已知含量不小于97.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

無色孔雀石綠(LMG)標準品：已知含量不小于99.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

結晶紫標準品：已知含量不小于97.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

無色結晶紫(LCV)標準品：已知含量不小于99.0%，美國Sigma-Aldrich公司；

乙腈：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；

乙酸銨：優級純；

二氯甲烷、鹽酸羥胺、對甲苯磺酸、冰乙酸、二甘醇：分析純；

混合提取溶液配制：稱取鹽酸羥胺13.4 g、對甲苯磺酸0.84 g、乙酸銨2.6 g溶于500 mL蒸餾水中，用冰乙酸調節溶液pH值為4.5；

硼氫化鉀溶液:0.2 moL/L,稱取0.54 g硼氫化鉀溶于燒杯中，定容于50 mL的容量瓶中；

試驗用水為符合GB/T 6682-1992規定的一級水。

1.2 儀器工作條件

Symmetry shieldRP C18不銹鋼色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1 moL/L乙酸銨溶液(pH 4.5,體積比為80∶20)，經0.45 μm濾膜過濾；流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：40.0℃；進樣體積：50 μL；激發波長：265 nm；發射波長：360 nm。按上述條件測定標準工作溶液，得標準譜圖見圖1。

1.3 實驗方法

(1)樣品提取

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)于50.0 mL離心管內，加入混合提取液10 mL，使用渦漩攪拌器充分混勻，加20 mL乙腈，以10 000 r/min勻漿2 min，放入-18℃的冰箱中冷凍30 min，將離心管放入高速冷凍離心機，于-5℃，以18 000 r/min離心15 min。中間清液用虹吸管轉移至250 mL的分液漏斗中。離心管中再次加入混合提取液10 mL、乙腈20 mL，重復上述操作，合并提取液，分液漏斗中加入10 mL硼氫化鉀溶液，充分混勻，放置反應10 min。

圖1 無色孔雀石綠及無色結晶紫標準溶液色譜圖

(2)樣品凈化

在250 mL的分液漏斗中加入飽和氯化鈉溶液30 mL，振蕩后靜置分層，取上層有機相于雞心瓶，用30 mL乙腈重復提取一次鹽溶液，合并有機層，于45℃旋轉蒸至近干，用少量乙腈溶解備用。丙基磺酸萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化小柱后，把雞心瓶中的溶液移到小柱上過濾，用5 mL乙腈洗滌雞心瓶兩次，把洗滌液依次通過小柱，吹丙基磺酸萃取小柱近干，用10 mL甲醇-乙酸乙酯-氨水(體積比為5∶4.5∶0.5)洗脫，收集在雞心瓶中，加0.5 mL乙酸中和，于45℃旋轉蒸至近干，用乙腈定容至1.0 mL，經0.45 μm濾膜過濾，上機。

(3)標準溶液的配制

稱取適量的孔雀石綠和結晶紫標準品，精確至0.1 mg，用乙腈配制成100 μg/mL的標準儲備液，于-18℃避光保存。用乙腈稀釋標準溶液，配制成1 μg/mL的孔雀石綠標準中間溶液，于-18℃避光保存。上機時準確吸取一定量孔雀石綠標準中間溶液，各加入0.05 mL硼氫化鉀溶液(0.2 moL/L)，用乙腈準確定容至5 mL，配制成標準溶液系列為0.2、0.5、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L。

2 結果與討論

2.1 提取方法的改進

幾種標準檢測方法經常會出現二氯甲烷反提步驟的分層不穩問題，由于不同水產品機體中蛋白質、脂肪含量和結構不同，檢測基質有較大差異，加入二氯甲烷進行反提的步驟常發生分層不明顯、二氯甲烷層忽上忽下的現象，易誤判造成所需要的二氯甲烷層被舍棄而導致實驗失敗。在GB/T 20361、GB/T 19857、SC 3021和SN/T 1479中都提到加入氧化鋁，用來除去蛋白質和脂肪，實驗表明，加入氧化鋁對回收率有較大影響，幾種標準方法在提取液濃縮時常見瓶中有白色泡沫產生且易暴沸沖出，雞心瓶內壁有大量脂肪，有時會留有殘液很難蒸干，暴沸的原因可能是提取液中含有一定量的蛋白質。為克服前處理時出現的這些困難，用冷凍和超高速離心的方法除去基質中的蛋白質和脂肪，實驗效果理想。

2.2 凈化方法的改進

本方法在分液漏斗中加入飽和氯化鈉溶液，使溶液更容易分層，由于鹽析作用，使極性弱的LMG和LCV更易轉入有機相。研究還發現，如果溶液中有MG和CV，加入飽和氯化鈉溶液提取會使MG和CV的回收率顯著降低，可能是由于MG和CV極性較強，在水溶液中以離子形態存在，加入飽和氯化鈉溶液，使溶液的離子強度增加，對MG和CV發生了離子化效應，使MG和CV更容易溶解在水溶液中。本方法洗脫時采用堿性甲醇+乙酸乙酯的混合液，研究顯示，10 mL堿性甲醇+乙酸乙酯混合液能把分析物完全洗脫。按國標的洗脫方法對樣品進行加標回收試驗，回收率較低，根據不同廠家的PRS柱，洗脫液在5～10 mL時才能完全洗脫。

2.3 回收率影響因素

待分析物質對光、熱和氧氣較為敏感，容易發生去甲基化和氧化降解，尤其是LMG和LCV。樣品提取時，加入還原劑鹽酸羥胺有助于防止待測物的降解氧化,加入離子對試劑對甲苯磺酸，有利于MG、CV形成離子對，增加乙腈對這兩種物質的提取效率。樣液濃縮時，比較了45℃條件下 N2吹干和旋轉蒸發濃縮待測組分的損失率。結果表明，采用N2直接吹干，各組分的損失率超過50%；旋轉蒸發濃縮的損失小，回收率大于95%。

2.4 線性方程與檢出限

用熒光檢測器測定0.2～20 μg/L范圍的無色孔雀石綠、無色結晶紫，以各組分的峰面積(y)對相應濃度(c,μg/L)繪制標準曲線，無色孔雀石綠的線性方程為y=2.015×107c-5.24×102，無色結晶紫的線性方程為y=3.872×107c-1.52×102,各組分的相關系數r≥0.998。

以樣品空白的3倍噪聲計算檢出限(LOD)，10倍噪聲計算定量限(LOQ)，得出無色孔雀石綠和無色結晶紫檢出限為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.5 回收率及精密度試驗

通過陰性樣品加標驗證該方法的回收率及精密度，孔雀石綠、結晶紫總量(全部還原為無色孔雀石綠和無色結晶紫)的加標回收率為78.3%～100.9%,相對標準偏差為1.3%～7.1%。回收率和精密度基本能滿足要求，試驗結果見表1。

表1 回收率和精密度試驗結果

3 結語

討論了水產品中孔雀石綠、結晶紫及其代謝產物標準檢測方法的優缺點，提出了一套簡單實用的前處理方法，對不同水產品的處理均達到預期的效果，有較好的適應性，是一種通用的快速檢測方法。該法有利于大批量樣品的測定，而且該方法靈敏度好、準確度高，精密度好，是值得推廣的水產品中孔雀石綠、結晶紫的檢測方法。

[1] 翟毓秀,張翠,寧勁松，等.水產品中的孔雀石綠殘留及其研究概況[J].海洋水產研究，2007,28(1)：101-108.

[2] SC 3021-2004 無公害食品 水產品中孔雀石綠殘留量的測定 液相色譜法[S].

[3] GB/T 20361-2006 水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法[S].

[4] GB/T 19857-2005 水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定[S].

[5] SN/T 1479-2004 進出口水產品中孔雀石綠殘留量檢驗方法[S].