高效液相色譜法同時測定牛肉組織中6種類固醇類激素類藥物*

衣聞聞 全 燦 金君素

(1.北京化工大學化學工程學院，北京 100029; 2.中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100013)

蛋白同化激素(Anabolic androgenic steroids，AAS)是具有環戊烷并多氫菲母核的類固醇類激素類藥物，主要為具有蛋白同化作用的雄性激素，能夠促進動物生長，在特定的飼喂期間可引起蛋白質沉積，提高飼料轉化率[1],因此在畜牧業養殖中得到廣泛的應用。然而，濫用類固醇類激素會造成其在動物組織中不同程度的殘留，從二十世紀八、九十年代開始，歐盟等西方發達國家對類固醇激素類藥物殘留進行了嚴格的限制[2]，我國農業部于2002年發布的第235號文件中規定丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、甲基睪酮、群勃龍等在動物性食品中的最高殘留限量為不得在動物性食品中檢出[3]。

目前，國內外有關動物組織中類固醇類激素的檢測方法研究較多,主要有高效液相色譜法(HPLC)[4]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[5-7]和液相色譜-質譜法(LC-MS)[8-12]。其中，氣相色譜-質譜法需要對類固醇類激素進行衍生化，且衍生化過程耗時長，重復性差，且目前存在的衍生化試劑均不能對目標物進行充分衍生[13]。

筆者以牛肉組織為原料，用高效液相色譜法同時測定其中美雄酮、諾龍、勃地龍、甲基睪酮、丙酸睪酮和丙酸諾龍的含量，以期建立樣品處理簡便、靈敏度高、特異性好的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Agilent 1100型，美國Agilent公司；

冷凍離心機：3K15型，美國Sigma公司；

漩渦混勻儀：MS3 Minishaker型，德國IKA公司；

電子天平：CP324s型，德國Sartorius公司；

水浴型氮吹儀：KL512型，美國Organomation公司；

超聲儀：5510型，美國Branson公司；

美雄酮[GBW(E)100085]、諾龍[GBW(E)100088]、勃地龍[GBW(E)100090]、甲基睪酮[GBW(E)100086]、丙酸睪酮[GBW(E)100087]、丙酸諾龍[GBW(E)100089]：均為溶液標準物質，中國計量科學研究院；

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、丙酮、乙酸乙酯：HPLC級，德國Merck公司；

實驗用水為Milli-Q超純水；

牛肉由北京某超市隨機購得。

1.2 標準工作液

取適量溶液標準物質，用甲醇稀釋，配制成6種目標化合物質量濃度均為10 mg/L的標準儲備溶液，置于-20℃的冰箱中保存。通過稀釋標準儲備溶液分別得到質量濃度為2.0 mg/L和10.0 mg/L的混合校準溶液。

1.3 樣品前處理

稱取絞碎后的牛肉(5±0.5)g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋30 s，超聲提取10 min，以8 000 r/min離心10 min，將上層有機相轉移至干凈的離心管中，再用10 mL乙腈重復提取兩次，合并上層有機相，用40℃氮氣吹干，加入2 mL甲醇溶液，渦旋30 s，全部溶解后，-20℃放置30 min，4℃時以10 000 r/min離心10 min，取適量上層液體過0.2 μm微孔濾膜，進行HPLC檢測。

1.4 儀器條件

色譜柱：Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；檢測波長：245 nm；流動相A為水，流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：流動相B初始值為55%，15 min內B由55%變化至70%，15～18 min，B由70%變化至90%，18～23 min，B由90%變化至55%；流速為1.0 mL/min。

1.5 校準曲線

取不同量的類固醇類激素標準儲備液，分別用甲醇配制成0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 mg/L的校準溶液。以待測物色譜圖的峰面積為縱坐標，相應待測物質量濃度為橫坐標，進行回歸運算，求得直線回歸方程。

1.6 回收試驗

分別向空白牛肉中添加質量濃度為2.0 mg/L和10.0 mg/L的混合校準工作液1 mL，制得0.4 mg/kg和2.0 mg/kg添加水平的樣品，按1.3方法處理，進行HPLC檢測，將測得的目標物峰面積代入校準曲線，計算測得的目標物濃度。

1.7 檢出限和定量限

取適量混合校準溶液逐級稀釋，分別根據3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限和定量限。

2 結果與討論

2.1 最佳波長的選擇

根據本課題組前期的研究成果，6種標準物質的最大吸收波長集中在239～245 nm,因此在此波長范圍內分別進樣，考察6種目標化合物的響應值之和，梯度為1 nm，結果見表1。由表1可知，6種目標化合物的響應值在245 nm處達到最大值，超過245 nm又有所下降，因此選用245 nm為檢測波長。

表1 6種目標化合物在各波長下的響應值之和

2.2 流動相的選擇

考察了梯度洗脫條件下，不同組成流動相的洗脫效果，比較了不同比例的乙腈-水和甲醇-水的洗脫效果。乙腈-水為流動相時6種目標化合物的出峰時間整體提前，分離效果較好，但是乙腈-水為流動相時使得樣品中更多雜質被洗出，且干擾目標化合物的峰形。甲醇-水為流動相時目標化合物與雜質峰能很好地分離，且6種目標化合物在23 min內可以很好地分離，因此選擇甲醇-水為流動相，其分離效果見圖1。

1—勃地龍； 2—諾龍； 3—美雄酮； 4—甲基睪酮；5—丙酸諾龍； 6—丙酸睪酮圖1 標準混合溶液的HPLC色譜圖

2.3 樣品前處理的優化

比較了叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5種有機溶劑的提取效果，其中乙腈和乙酸乙酯的提取液中目標化合物的回收率最高，5種有機溶劑分別作為提取溶劑時提取的目標化合物回收率見表2。乙酸乙酯的提取液背景雜質較多，而乙腈提取的背景干擾較少，譜圖更加清晰，因此選用乙腈為提取溶劑。5種有機溶劑分別作為提取溶劑提取后的色譜圖見圖2。

表2 5種有機溶劑分別用作提取溶劑時6種目標化合物的回收率

1—勃地龍； 2—諾龍； 3—美雄酮； 4—甲基睪酮；5—丙酸諾龍； 6—丙酸睪酮圖2 5種有機溶劑分別提取的目標化合物液相色譜圖

脫脂是動物基質前處理中必不可少的步驟，文獻[11]報道多采用正己烷脫脂法，本實驗也嘗試了正己烷除脂法，但由于類固醇類激素均是脂溶性激素，在正己烷中有一定的溶解度，造成目標物回收率偏低[14]。經過多次試驗，本實驗最終采用低溫冷凍脫脂[6]的前處理方法，在-20℃下用甲醇復溶后進行30 min低溫冷凍處理，溶出脂肪，通過離心將脂肪除去，樣品前處理快速簡捷。加標水平為2.0 mg/kg的6種蛋白同化類固醇類激素的提取色譜圖見圖3。圖3中同時給出了空白牛肉的色譜圖，通過對比可以看出，所采購的牛肉中不含有6種目標化合物。

1—勃地龍；2—諾龍；3—美雄酮；4—甲基睪酮；5—丙酸諾龍；6—丙酸睪酮圖3 空白牛肉和加標量為2.0 mg/kg的HPLC色譜圖

2.4 線性方程與檢出限

按1.5求得線性回歸方程，按1.7計算方法的檢出限和定量限，線性回歸方程、檢出限和定量限結果見表3。在0.25～10 mg/L的質量濃度范圍內，美雄酮、諾龍、勃地龍、甲基睪酮、丙酸睪酮和丙酸諾龍等6種類固醇類激素的線性良好，相關系數r2均大于0.999。

表3 6種目標化合物的線性方程、線性范圍、檢出限和定量限

2.5 回收試驗與精密度試驗

6種類固醇類激素類藥物在0.4 mg/kg和2.0 mg/kg的添加水平下，平均回收率為84.1%～100.2%，每個添加水平下平行測定5個樣品，精密度為0.5%～3.5%，結果見表4。

表4 加標回試驗和精密度試驗結果(n=5)

3 結論

建立了HPLC同時快速測定牛肉組織中美雄酮、勃地龍、諾龍、甲基睪酮、丙酸諾龍和丙酸睪酮6種蛋白同化類固醇類激素殘留量的方法。樣品的前處理簡便、快速，方法的靈敏度好，精密度高，完全適用于動物肌肉組織中蛋白同化類固醇類激素多殘留的分析檢測。

[1] 許泓，林安清，古瓏，等.動物組織中8種同化性激素及代謝物殘留量的檢測方法研究[J].分析測試學報，2008，27(12)：1 278.

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