GC-MS法測定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的測量不確定度評定*

譚波濤 郝媛媛

(安徽省阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，阜陽 236000)

氨基甲酸乙酯又名聚氨酯(ethyl carbamate，簡稱EC)存在于發(fā)酵食品中，是一種多位點致癌物[1]。針對發(fā)酵食品中EC的測定，目前主要以儀器分析為主，如高效液相色譜-熒光檢測器法(HPLC-FLD)[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3-5]等。筆者以氨基甲酸丁酯作為內(nèi)標物，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、選擇離子檢測模式用于發(fā)酵食品中EC的測定，并對EC測量結(jié)果的不確定度進行了評估。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：5975C型，配多功能自動進樣器，美國Agilent公司；

固相萃取裝置：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000型，上海申勝生物技術(shù)有限公司；

超聲波儀：SK1200H型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

去離子水發(fā)生器：AXLB1020-1型，重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司；

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯：色譜純；

無水硫酸鈉：經(jīng)650℃灼燒4 h，置于干燥器內(nèi)備用；

標準品EC、氨基甲酸丁酯：純度均為99.0%，上海安譜科技有限公司；

實驗室用水均為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Rtx?-Wax(30 m×0.25 mm，0.5 μm，美國瑞斯泰克公司)或相當者；進樣口溫度：220℃；柱溫程序：初溫40℃，保持1.0 min,以10℃/min升至60℃，再以5℃/min升至160℃，保持1.0 min，最后在220℃下運行10 min；載氣：高純氦氣(99.999%)，流速：1.0 mL/min；不分流進樣；進樣體積：1 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源(EI)溫度：230℃；電子轟擊能量：70 eV；接口溫度:220℃；電子倍增器電壓:1 157 V；選擇離子監(jiān)測方式(SIM)；EC定量離子：m/z62；特征離子：m/z62、74、89；內(nèi)標物氨基甲酸丁酯定量離子：m/z62；特征離子：m/z62、74、56；溶劑延遲時間：19.0 min。

1.4 樣品前處理

準確稱取5.0 g固體樣品或準確吸取5.0 mL液體樣品于25 mL比色管中，加入氨基甲酸丁酯內(nèi)標,飽和氯化鈉溶液溶解并定容至刻度，振蕩提取30.0 min，過濾。準確移取上述待測樣液5.0 mL加到5.0 g的硅藻土液液萃取小柱上，靜置吸附5 min，用30 mL二氯甲烷均分6次洗脫硅藻土萃取柱，將洗脫液用無水硫酸鈉過濾后于30℃下旋干，用乙酸乙酯定容至5.0 mL，混勻，待測。

1.5 標準曲線的繪制

準確稱取氨基甲酸丁酯0.104 2 g于100 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.042 mg/mL的氨基甲酸丁酯標準儲備液。準確稱取EC 0.105 7 g于100 mL棕色容量瓶中，乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.057 mg/mL的EC標準儲備液。準確吸取EC、氨基甲酸丁酯的標準儲備液，乙酸乙酯溶解逐級稀釋，配制成EC與內(nèi)標物濃度的比值分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0且內(nèi)標物濃度為400 ng/mL的標準校正溶液系列濃度供GC-MS測定。

1.6 定性定量

吸取1 μL試樣液或標準液注入氣質(zhì)聯(lián)用儀中，以EC與內(nèi)標物濃度的比值為橫坐標，EC與內(nèi)標物的峰高比值為縱坐標，繪制標準工作曲線。以試樣峰與內(nèi)標峰的相對保留時間定性，以試樣峰與內(nèi)標峰的定量離子峰高比多點校正后定量。

2 數(shù)學(xué)模型

樣品中EC含量測量結(jié)果可以表示為：

式中：X——試樣中EC含量，ng/g；

Asn——實際樣品中EC的峰高；

As1——實際測定時，內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的峰高；

ms1——實際測定時，內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的質(zhì)量，ng；

m——樣品質(zhì)量，g；

fv——實際測定時樣品和內(nèi)標物稀釋倍數(shù)；

R——EC及其內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的相對校正因子，

An——EC標樣的峰高；

c1——內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的濃度，ng/mL；

A1——內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的峰高；

cn——EC的濃度，ng/mL。

3 測定結(jié)果

5個標準溶液分別測量3次，結(jié)果見表1、表2。

表1 EC-氨基甲酸丁酯標準校正液峰高系列測定結(jié)果

表2 EC-氨基甲酸丁酯標準校正液中標準品峰高(Ani)與內(nèi)標峰高(A1i)之比的測定結(jié)果

根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù)作標準工作曲線，線性方程為y=1.310 225x-0.002 434，其中曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，b=1.310 225，a=-0.002 434。當內(nèi)標濃度為400 ng/mL時，重復(fù)性條件下測定樣品6次，對應(yīng)的樣品濃度比和樣品測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果

4 發(fā)酵食品中EC測量結(jié)果的不確定度評定

從實驗方法和數(shù)學(xué)模型可以看出，檢驗由標準液制備、樣品制備、儀器測定等幾部分組成。因此測量不確定度的主要來源有(1)EC及其內(nèi)標物氨基甲酸丁酯相對校正引入的不確定度；(2)內(nèi)標物純度及樣品和內(nèi)標物稱量引入的不確定度；(3)定容配制測量液、進樣引入的測量不確定度;(4)實際測量過程中，樣品中EC的峰高和內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度；(5)重復(fù)性測量引入的不確定度。

4.1 EC及其內(nèi)標物氨基甲酸丁酯校正引入的不確定度

(1)擬合標準工作曲線求值引入的不確定度

以EC與內(nèi)標物濃度的比值X為橫坐標，EC與內(nèi)標物的峰高比值Y為縱坐標繪制標準工作曲線，曲線的斜率即為相對校正因子R。根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù)，標準工作曲線中殘余標準差S和標準工作曲線中自變量偏差平方和Sxx分別為：

測量樣品溶液6次，即P=6，根據(jù)表3數(shù)據(jù)，樣品溶液由于擬合標準工作曲線求值引入的不確定度為：

其相對標準不確定度：

(2)EC-氨基甲酸丁酯標準校正液濃度比引入的測量不確定度

配制EC-氨基甲酸丁酯標準校正液時，EC標準品和內(nèi)標標準品稱量、定容等過程將引入不確定度。但是使用線性最小二乘法擬合曲線、求取相對校正因子的前提是假定橫坐標量的不確定度遠小于縱坐標量的不確定度[6,7]。通常的An/Al不確定度計算程序僅僅與EC和內(nèi)標物的峰高比值有關(guān)，而與EC-氨基甲酸丁酯標準校正液不確定度無關(guān)，也不與從同一溶液中逐次稀釋產(chǎn)生必然的相關(guān)性，因此EC-氨基甲酸丁酯標準校正液濃度比引入的測量不確定度可以忽略不計。

4.2 內(nèi)標物純度及樣品和內(nèi)標物稱量引入的不確定度

(1)根據(jù)氨基甲酸丁酯的標準物質(zhì)證書，標樣的相對標準不確定度為1.0%,按照正態(tài)分布估算，取包含因子為3。則內(nèi)標的相對標準不確定度un1,rel約為0.0034。

4.3 實際測量時，內(nèi)標物稱量、定容配制測量液引入的測量不確定度

(1) 使用容量瓶、移液管或移液槍所引入的體積不確定度主要有3個分量:①體積校準引入的不確定度分量uV1，按JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》規(guī)定的容量允差計算；②充滿液體至刻度的變動性引入的不確定度分量uV2，通過A 類不確定度評定得到，具體做法為連續(xù)核查10 次排出的體積的標準偏差(通過稱量決定)；③溶液溫度與檢定標準溫度(20℃) 不同引入的不確定度分量uV3，根據(jù)溶液體積膨脹系數(shù)計算。

(3)在估算溫度變化對體積不確定度影響時，認為實驗室的溫度一般在±4℃之間變動。液體體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮前者。乙酸乙酯的體積膨脹率按照20℃時系數(shù)1.39×10-3/℃計算。根據(jù)實驗情況，各體積不確定度見表4。

表4 容量瓶、移液管或移液槍引入的相對標準不確定度

4.4 樣品測量中EC的峰高和內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度

4.5 重復(fù)性測量引入的不確定度

重復(fù)性測量引入的不確定度采用A類評定。表3數(shù)據(jù)在格拉布斯檢驗0.95置信水平下無粗大異常值。根據(jù)貝塞爾公式，計算6次測量標準差的相對值為：

5 相對合成標準不確定度和相對擴展不確定度

根據(jù)以上評估過程，將不確定度的A類評定結(jié)果和各分量評估結(jié)果合成，得出相對合成標準不確定度:

X=21.51 ng/mL,Urel=8.7%,k=2。

6 結(jié)語

通過對發(fā)酵食品中EC含量測量過程中影響測量結(jié)果不確定度的各因素進行分析，結(jié)果表明，在測量結(jié)果的合成不確定度中，擬合標準曲線求值引入的不確定度分量貢獻最大，其次是由樣品測量中EC的峰高和內(nèi)標物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度分量。其原因是由于檢測器的計量特性、樣品分離條件和檢測重復(fù)性引入了較大的不確定度。由于測定采用了內(nèi)標法，進樣量變化和實驗條件變化引入的誤差將因為測定的峰高比(Asn/Asl)而相互抵消。合理選擇樣品分離條件、提高儀器精度、提高操作人員技能、保證人員規(guī)范操作、合理選擇內(nèi)標物的濃度、使其峰高與待測組分峰高不要相差太大，都可以有效減少不確定度，保證測量結(jié)果的準確、可靠。

[1] European Food Safety Authority. Ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages Scientific Opinion of the Panel on Contaminants[J]. The EFSA Journal，2007，551：1-44.

[2] Arminda Alves， Beatriz Oliveira， Paulo Herbert. Determination of ethyl carbamate in alcoholic beverages:an interlaboratory srudy to compare HPLC-FLD with GC-MSmethods[J]. Anal Bioanal Chem，2005，382：498-503.

[3] AOAC Official Method 994.07 Ethyl Carbamate in Alcoholic Beverages and Soy Sauce Gas Chromatograpy/Mass Selective Detection Method [S].

[4] 劉曉毅，劉艷琴，趙玉琪，等.醬油中的氨基甲酸乙酯檢測方法研究[J].中國調(diào)味品，2010，35(1):81-84.

[5] 高年發(fā),寶菊花.氨基甲酸乙酯的研究進展[J].中國釀造，2006,162(9):1-4.

[6] JJF 1059-1999 測量不確定度評定與表示 [S].

[7] CNAS-GL06 化學(xué)分析中不確定度的評估指南[S].

[8] Eurachem/Citac Guide: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement[S].