柔肝瀉脂方對非酒精性脂肪肝大鼠 SOD、MDA的影響*

上海中醫藥大學附屬龍華醫院內科(上海 200032）

柔肝瀉脂方對非酒精性脂肪肝大鼠 SOD、MDA的影響*

陳瓊項曉覺毛娜上海中醫藥大學附屬龍華醫院內科(上海 200032）

目的:探討柔肝瀉脂方對非酒精性脂肪肝大鼠超氧化物歧化酶(SOD）和脂質過氧化物(LPO）的降解產物丙二醛(MDA）的影響。方法:以高脂飲食建立大鼠脂肪肝模型,造模成功后給予中藥“柔肝瀉脂方”干預 4周后檢測各組大鼠血清和肝勻漿 SOD、MDA的含量變化。結果:模型組大鼠血清和肝勻漿中 SOD水平明顯低于正常組,MDA含量明顯高于正常組;通過給藥治療,與模型組比較,柔肝瀉脂方各組血清及肝勻漿中 SOD水平均明顯增高,MDA含量顯著降低;與血脂康組比較,大鼠肝勻漿 SOD含量升高及 MDA含量降低以柔肝瀉脂方預防組和大劑量組最為顯著。結論:柔肝瀉脂方可以顯著提高血清和肝組織的抗氧化能力,抵御肝細胞的氧應激和過氧化,使肝細胞免受損傷,達到預防和治療脂肪肝的目的。

MDA反應除干擾肝內脂質代謝外,還導致自由基生成增多,使得細胞膜脂質氧化,肝細胞結構與功能損害[1],MDA反應的產物除破壞生物膜、蛋白質、核酸等大分子物質外,還可誘導炎性細胞浸潤,激活肝枯否氏細胞(KupffersCell）和肝星形細胞(HSC）,引發纖維化[2]。因此 MDA異常是導致脂肪肝的重要因素之一[3-4],我們通過高脂飲食建立脂肪肝模型,旨在研究和探討在全國著名老中醫姚培發教授治療脂肪肝經驗方的基礎上,進一步改進而成的“柔肝瀉脂方”對非酒精性脂肪肝(NAFL）大鼠超氧化物歧化酶(SOD）,脂質過氧化物的降解產物丙二醛(MDA）影響及相關機制。

1 材料 1.1 實驗動物 Wistar大鼠:45只,雄性,8周齡,體重:215±15g。中科院上海實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(滬 ）2003-0003。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心 SPF級動物房。

1.2 藥物 柔肝瀉脂方(何首烏 20g,枸杞子、生地各12g,澤瀉 20g,丹參 30g,生山楂 15g）,按處方比例將各藥材加水煎煮 2次,過濾 ,合并 ,按人鼠等效劑量換算,濃縮生藥濃度為 1.06g/mL(柔肝瀉脂方小劑量 ）,2.11g/mL(柔肝瀉脂方中劑量）及 4.23g/mL(柔肝瀉脂方大劑量）備用。血脂康膠囊 (國藥準字號 Z10950029,批號 20030925）,成人日服 1.2g,按人鼠等效劑量換算,研磨后用滅菌蒸餾水稀釋濃度為 0.01g/mL。

1.3 試劑 TG:寧波博泰生物技術有限公司 (批號041014）;CHOL:寧波博泰生物技術有限公司(批號 050302）。

1.4 飼料 正常組給予普通顆粒飼料,其它各組 1～ 6周給予高脂飼料。高脂飼料配方如下:10%豬油,1%膽固醇,5%蔗糖,0.5%膽鹽,0.2%丙硫氧嘧啶,83.3%基礎飼料。

2 方法 2.1 分組 45只大鼠自由飲水進食適應性喂養 1周后,隨機分為 6組,正常對照組 5只,模型組、柔肝瀉脂方小劑量組、柔肝瀉脂方中劑量組、柔肝瀉脂方大劑量組、血脂康組各 8只。

2.2 飼料及給藥 正常組 1～ 10周給予正常飼料,其余各組 1～ 6周給予高脂飼料,7～ 10周改為正常飼料。正常組及模型組從第 7周起給予蒸餾水 10mL/kg灌胃直至第 10周末。余下各組從第 7周起分別給予不同劑量的柔肝瀉脂方或血脂康灌胃,直至第 10周末。

2.3 取材 第 10周末,于最后 1次給藥后禁食 12h,2%戊巴比妥納 40mg/kg腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,一部分室溫放置 30min,離心取上清待測血脂、SOD、MDA等指標,迅速剖取肝臟,冰生理鹽水洗滌 ,濾紙拭干后稱量肝重,于肝右葉距邊緣 0.5cm取兩塊 1cm3裝入 eppdorf管,-70℃保存待做肝組織勻漿。

2.4 觀測指標 血清、肝勻漿 SOD的測定:按試劑盒說明操作;血清、肝勻漿 MDA的測定:按試劑盒說明操作。

3 結 果 實驗過程中各組大鼠均無死亡,各組大鼠體重緩慢持續增長,活動靈敏,組間未見明顯差異。各組大鼠血清、肝勻漿 SOD、MDA的變化如下表所示:

3.1 各組大鼠血清 SOD,MDA的變化 見表 1。

表1 各組大鼠血清 SOD,MDA的變化 (±s）

表1 各組大鼠血清 SOD,MDA的變化 (±s）

注:與模型組相比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

組 別 n SOD(NMOL/ML） MDA(NU/ML）正常組 5 196.038±3.708▲ 2.265±0.201▲模型組 8 140.013± 5.800 3.859± 0.430預防組 8 190.307±3.452▲◇ 2.848±0.347▲小劑量組 8 154.736±8.448△ 3.030±0.700中劑量組 8 160.961±6.559▲ 2.550±0.322▲大劑量組 8 195.643±4.511▲◆ 2.285±0.352▲血脂康組 8 170.644±10.601▲ 2.517±0.317▲

圖1 正常組×100倍大鼠肝細胞未見脂肪變性

圖2 模型組×100倍大鼠肝細胞發生顯著脂肪變性

從表 1可知,模型組大鼠血清 SOD含量明顯低于正常組,MDA明顯高于正常組,差異均有顯著性意義 (P＜0.01）。藥物干預后,與模型組比較:柔肝瀉脂方各組及血脂康組 SOD含量均顯著增高(P＜0.05,P＜0.01）;MDA含量均顯著降低 P＜0.01(除柔肝瀉脂方小劑量組）。

柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較:柔肝瀉脂方預防組、大劑量組血清 SOD含量顯著升高(P＜0.05,P＜0.01）;MDA含量無明顯差異(P＞0.05）。

3.2 各組大鼠肝勻漿 SOD,MDA的含量變化 見表 2。

表2 各組大鼠肝勻漿 SOD,MDA的變化(±s）

表2 各組大鼠肝勻漿 SOD,MDA的變化(±s）

注:與模型組相比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

組 別 n SOD(NMOL/ML） MDA(NU/ML）正常組 5 54.279±4.936▲ 0.193±0.024▲模型組 8 45.575±1.549 0.288±0.034預防組 8 53.134± 0.913▲◆ 0.203± 0.029▲◆小劑量組 85 1.116± 1.705▲ 0.214± 0.026▲◇中劑量組 8 51.023±1.391▲ 0.224± 0.035▲◇大劑量組 8 55.416± 0.727▲◆ 0.188± 0.032▲◆血脂康組 8 50.410±1.466▲ 0.261±0.057

從表 1可知:模型組大鼠肝勻漿 SOD含量明顯低于正常組,MDA含量明顯高于正常組,差異均有顯著性意義(P＜0.01）。藥物干預后,與模型組比較:柔肝瀉脂方各組 SOD含量均顯著增高(P＜0.01）,MDA含量均顯著降低(P＜0.01）;血脂康組 SOD含量顯著增高 (P＜0.01）,MDA含量有降低趨勢,但尚無統計學意義。柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較:SOD含量預防組和大劑量組升高顯著(P＜0.01）,MDA含量各組均顯著降低(P＜0.05,P＜0.01）。

3.3 肝組織病理變化 HE染色觀察 正常組大鼠肝細胞未見脂肪變性(見圖 1）,模型組大鼠肝細胞發生顯著脂肪變性(見圖 2）,治療組肝細胞脂肪變程度明顯較輕(見圖 3）,對照組肝細胞脂肪變程度好于模型組 (見圖 4）。

圖3 治療組×100倍肝細胞脂肪變程度明顯較輕

圖4 對照組×100倍肝細胞脂肪變程度好于模型組

4 討 論(SOD）是超氧離子自由基的專一特效金屬歧化酶,通過清除自由基,起到保護機體的作用,對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用。機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基,氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸,引發脂質過氧化作用,形成脂質過氧化酶 MDA,MDA的含量反映機體內脂質過氧化的程度,間接反應出肝細胞受損程度。各種原因導致的肝臟脂肪沉積,肝細胞脂肪變性,主要是因為大量還原型輔酶 1(NADH）作用的結果,NADH濃度增高抑制脂肪酸的β氧化 ,使細胞內游離脂肪酸增加,游離脂肪酸濃度增加可促進氧化物酶體的 β氧化,產生大量高度活性的自由基,自由基使脂質過氧化,脂質過氧化后產生 MDA增加,MDA增加使細胞內抗氧化劑 SOD消耗增加,含量顯著性下降。這一點通過本實驗中也得以證實:模型組大鼠血清和肝勻漿中 SOD水平明顯低于正常組,MDA含量明顯高于正常組。通過藥物干預后,與模型組比較,柔肝瀉脂方各組血清及肝勻漿中 SOD水平均明顯增高,各組血清中 MDA含量顯著降低。與血脂康組比較:柔肝瀉脂方預防組和大劑量組大鼠肝勻漿 SOD含量升高及MDA含量降低最為顯著。說明脂肪肝肝內脂質沉積,引起脂質過氧化反應,導致抗氧化能力下降,自由基生成增多,而自由基可通過氧化細胞膜的脂質導致肝細胞結構與功能的變化,因此脂質沉積的增多加重了脂質過氧化反應,而脂質過氧化反應可干擾肝內脂類代謝。藥物干預后顯示,柔肝瀉脂方可以顯著提高血清和肝組織的抗氧化能力,抵御肝細胞的氧應激和過氧化,使肝細胞免受損傷,達到治療脂肪肝的目的,這也是柔肝瀉脂方治療脂肪肝的機制之一。柔肝瀉脂方由何首烏、枸杞子、生地、虎杖、菝葜等組成,藥理學研究表明,何首烏能從膽固醇的吸收、代謝等多途徑防治高脂血癥及動脈硬化癥,降低血液的高凝狀態,并能降低組織中 MDA含量,提高機體組織細胞SOD的活性以及減少氧自由基對組織細胞的損害[5]。枸杞能提高肝組織中超氧化物酶 SOD的活性,維持機體氧化及抗氧化系統的動態平衡,從而使組織的細胞免受自由基的侵害[6],此外枸杞多糖對動脈粥樣硬化還有明顯的預防和治療作用,可能與其抗氧化、免疫調節、提高 HDL-C/Tch有關[7]。菝葜具有活血化瘀的藥理作用,表現在抑制血小板聚集和延長內源性凝血時間,并同時伴有對纖維蛋白原生成的影響,對血小板的數目沒有明顯影響[8-9]。并有報道表明復方菝葜有增加荷瘤鼠血清中SOD活力,降低 MDA含量的作用[10]。虎杖中的白藜蘆醇是一個自由基清除劑 ,虎杖還具有改善微循環,抑制白細胞,血小板與內皮細胞黏附的作用。由此可推測,柔肝瀉脂方可能通過清除自由基,抗氧化,調節膽固醇的吸收代謝等多途徑來治療和干預脂肪肝,達到治愈脂肪肝目的。

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柔肝瀉脂方 /藥效學 大鼠 實驗研發

R57

A

1000-7369(2011）01-0103-03

*上海市教委課題(編號 02ck01）

(收稿 2010-08-15;修回 2010-09-20）