血脈通2號顆粒對血管內皮細胞 MMPs及其相關因子的研究*

斌霞 奕民 江蘇省常州市中醫醫院心內科(常州 213003）

血脈通2號顆粒對血管內皮細胞 MMPs及其相關因子的研究*

張琪張斌霞張奕民王紫逸江蘇省常州市中醫醫院心內科(常州 213003）

目的:觀察血脈通 2號顆粒對血管內皮細胞基質金屬蛋白酶(MMPs）及其相關因子的影響。方法:通過體外培養血管內皮細胞,血脈通 2號顆粒含藥血清干預,采用血管內皮細胞增殖實驗(MTT）檢測血管內皮細胞活性,酶聯免疫雙抗夾心法測定 MMPs及其相關因子的表達。結果:血脈通 2號可增強血管內皮細胞活性,降低轉化生長因子(TGF-β）、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(EMMPRIN）的水平,對基質金屬蛋白酶表達呈劑量相關性抑制作用。結論:血脈通 2號可增強血管內皮細胞活性,在體外可影響 MMPs相關因子的表達,進而抑制血管內皮細胞表達基質金屬蛋白酶,具有穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

血脈通 2號顆粒是江蘇省名中醫張琪用于治療動脈粥樣硬化的系列經驗方之一,已制成院內制劑,臨證收到良好療效,為進一步探討其作用機理,我們進行了實驗研究,報道如下。

1 實驗材料1.1 細胞、藥物及試劑 VEC(人血管內皮細胞）購自上海細胞所,96孔板 (美國 COSTOR公司）DMEM(美國 GBICO公司 ）,小牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司產品）,胰蛋白酶(Typrin,1:250,Amerso,USA）,溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT上海伯奧生物科技公司）,二甲基亞砜(廣東光華化學廠有限公司 ）,血脈通 2號顆粒,為常州市中醫院自制制劑(成分為生首烏、黃芪、僵蠶、水蛭、赤芍、川芎,主要用于頸動脈粥樣硬化的治療）每 1g顆粒相當于 4.09g生藥,由江蘇天江藥業有限公司提供。洛伐他汀(批號 080902,山東羅欣藥業股份有限公司）。

1.2 儀器 倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司產品）,5% CO2培養箱 (USA）,酶標儀(國營華東電子管廠）,離心機(北京醫用離心機廠）,電熱恒溫水溫箱(上海醫用恒溫設備廠）;超凈工作臺(蘇州凈化設備廠）。

2 實驗方法2.1 含藥血清的制備 取大鼠 15只,隨機分為 5組,每組 3只,給藥前禁食 12h,不禁水。各組大鼠每日給藥 1次,連續給藥 7d。最后一次給藥后 2h,大鼠頸動脈取血,分離血清。同組血清合并,56℃水浴滅活 30min,用 0.122um的微孔濾膜過濾除菌,置-20℃保存備用。空白對照組,給予等容積生理鹽水;陽性對照組,給予洛伐他汀 6.67mg/kg;血脈通低、中、高劑量組,分別給予血脈通顆粒 7.5g/kg,15g/kg,30g/kg。

2.2 細胞培養 2.2.1復蘇與傳代:取出貯存細胞 ,37℃水浴中快速融化。把 1～ 2mL凍存細胞的混合物加入到大約10mL完全生長培養基中,輕輕混勻。 500～ 1000轉離心 5min。棄去上清。接種于含 8%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1mol/LHEPES的 HGDMEM培養液中,37℃、5%CO2條件下培養。細胞接種應該至少為 603× 105活細胞 /mL。當細胞生長至單層致密狀時,用 0.25%胰蛋白酶消化后以 1:3傳代,24h換液,72h再次傳代。

2.2.2 細胞分組:陰性對照組:每孔加入 160uL細胞懸液,共 8孔;30min后 ,每孔均加入 40uL培養液;H2O2(100umol/L）模型組:每孔加入 160uL細胞懸液,共 8孔,每孔均加入20uL100umol/LH2O2,30min后,加入 20uL培養液;空白組:每孔加入 160uL細胞懸液,共 8孔 ,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加空白血清;陽性組:每孔加入 160uL細胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL陽性組的含藥血清;低劑量組:每孔加入 160uL細胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL低劑量組的含藥血清;中劑量組:每孔加入 160uL細胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL中劑量組的含藥血清;高劑量組:每孔加入160uL細胞懸液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后 ,再加 20uL高低劑量組的含藥血清。

2.3 血管內皮細胞增殖實驗(MTT） 將血管內皮細胞接種于培養瓶中,加入 DMEM培養液于 37℃,5%CO2培養箱中培養,每 2天傳代 1次,傳代時用 0.25%胰蛋白酶消化2min。

取處于指數生長期的細胞,加入適量 0.25%胰蛋白酶消化2min。用含 10%小牛血清的 DMEM培養液配成細胞懸液 ,用細胞計數板計數后,以培養液稀釋細胞,使之配成 2×105/mL細胞懸液,加入 96孔板。使給藥組每孔含細胞懸液 160μL,藥液占 20μL,生理鹽水 20μL,對照組含細胞懸液 160μL,生理鹽水 40μL。在 37℃,5%CO2培養箱中孵育 24h。 24h后每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液,37℃溫育 4h,吸出 上清液,加入100μLDMSO,混勻后用酶標儀在 490nm處 ,測定每孔 OD值。

2.4 血管內皮細胞 MMPs及其相關因子的蛋白表達檢測 用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法測定,按照各試劑盒說明進行操作。

4 結果 4.1 不同濃度血脈通 2號對 H2O2損傷血管內皮細胞活性的影響作用 見表 1,血管內皮細胞活性與細胞陰性對照組相比 H2O2損傷模型組明顯下降,而經含藥血清作用,低、中、高劑量組和陽性組的細胞活性均有不同程度增加,與模型組對比,有顯著性差異,血脈通與陽性組組間比較提示血脈通 2號中劑量組與陽性組增強內皮細胞活性作用相當,而低、高劑量組與陽性組有組間差異,陽性組作用優于低、高劑量組。22

表1 血脈通 2號對 HO損傷血管內皮細胞活性的影響作用(±s）

表1 血脈通 2號對 HO損傷血管內皮細胞活性的影響作用(±s）

組 別 H2O2模型組 空加 H2O2 陽性組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 空白不加 H2O2 陰性對照組細胞活性 0.33± 0.06◇ 0.77± 0.03▲△ 0.86± 0.05▲ 0.75± 0.09▲◆ 0.83± 0.06▲ 0.95±0.04▲◆ 1.02± 0.05◇▲ 0.83±0.02▲

注:與空白不加 H2O2對比,△P＜0.01;與模型組對比,▲ P＜0.01;與細胞陰性對照組對比,◇ P＜0.01;與陽性組對比,◆ P＜0.01。

4.2 對血管內皮細胞基質金屬蛋白酶及其相關因子的影響 見表 2,模型組和空白組 MMP-2、TGF-β、EMMPRIN發生了明顯的變化,較陰性對照組有顯著性差異,經含藥血清干預后,與模型組相比血脈通 2號高劑量組和陽性組 MMP-2降低有顯著性差異,與空白組相比血脈通 2號高劑量組和陽性組MMP-2降低也出現了顯著性差異,血脈通高劑量組與陽性組組間比較無差異,提示這兩組在降低 MMP-2方面作用相當;與模型組相比血脈通 2號中、高劑量組和陽性組降低 TGF-β出現了顯著性差異,與空白組相比血脈通各劑量組和陽性組降低TGF-β也出現了顯著性差異,血脈通各劑量組與陽性組組間比較無差異,提示在降低 TGF-β方面血脈通各劑量組與陽性組作用相當;與模型組相比血脈通 2號各劑量組和陽性組降低EMMPRIN出現了顯著性差異,與空白組相比血脈通 2號各劑量組和陽性組降低 EMMPRIN也出現了顯著性差異,血脈通高劑量組與陽性組組間比較無差異,提示在降低 EMMPRIN方面血脈通高劑量組與陽性組作用相當,而血脈通低、中劑量組與陽性組組間比較有差異,提示陽性組作用優于低、中劑量組。

表2 血脈通 2號對血管內皮細胞基質金屬蛋白酶及其相關因子表達的影響(±s）

表2 血脈通 2號對血管內皮細胞基質金屬蛋白酶及其相關因子表達的影響(±s）

注:與正常組對比△ P＜0.05,▲P＜0.01;與模型組比較◇P＜0.05,◆P＜0.01;與空白組比較□ P＜0.05,■P＜0.01;與陽性組比較○ P＜0.05,● P＜0.01。

組 別 孔 數 給藥劑量(mL） MMP-2(ng/mL） TGF-β(pg/mL） EMMPRIN(pg/mL）陰性組 8 0.5 2.98± 0.86 51.50± 10.49 15.09± 4.81空白組 8 0.59.26± 2.23▲ 105.70± 12.43▲ 139.11± 2.94▲模型組 8 0.59.33± 0.56▲ 102.53±2.06▲ 143.09± 4.70▲陽性組 8 0.55.51± 1.96◆△■ 74.41±15.07◆▲■ 30.22±4.47◆■▲低劑量組 8 0.57.75±1.99▲○ 88.73±13.79▲○ 43.97± 1.87◆▲■●中劑量組 8 0.57.64±0.82▲○ 86.49±7.33◇▲□ 36.98± 9.09◆▲■○高劑量組 8 0.55.75± 1.02◆▲■ 81.79±14.33◆▲■ 30.59±2.32◆▲■

5 討 論 血管內皮細胞處于血液和血管壁組織之間,易受多種因素的損傷。研究證明,血管內皮細胞的結構損傷和功能障礙是許多血管病變的始動因素,與冠心病、高血壓等疾病的發生發展密切相關。本實驗采用體外培養的血管內皮細胞,用 H2O2損傷,血脈通 2號含藥血清干預,觀察對內皮細胞增殖活性的直接作用及對 H2O2所致內皮細胞損傷的保護作用。研究發現,血脈通 2號可以增強血管內皮細胞的活性,用于血管內皮損傷的修復,對 H2O2所致的內皮增殖活性的抑制具有良好的保護作用。

基質金屬蛋白酶與動脈粥樣硬化斑塊的穩定性密切相關,其表達受到一些調控因子的影響。其中細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子 (extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）是 MMPs的主要調節因子,EMMPRIN不僅誘導MMPs的產生而且與多種細胞及細胞因子相互作用參與 AS的發生發展過程。EMMPRIN通過自分泌和旁分泌途徑,誘導成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞等表達基質金屬蛋白酶[1,2]。EMMPRIN在動脈粥樣硬化相關細胞以及人類動脈粥樣硬化斑塊內高表達[3～5],在富含平滑肌細胞的頸動脈斑塊中低度糖基化的 EMMPRIN含量很高并與 MMP-2表達呈正相關,而在富含巨噬細胞的斑塊中多為高度糖基化的 EMMPRIN并與MMP-9表達量呈正相關[5]。本實驗發現,血脈通 2號低、中、高劑量組的 EMMPRIN與模型組和空白組相比均出現了有統計學意義的差異,與 MMP-2下降呈直線相關。

轉化生長因子-β(TGF-β）通過對 MMPs和 TIMPs家族成員因細胞類型而異的基因表達調控作用,表現出調節 ECM重建的生物學效應[6]。TGF-β可通過激活 Smad通路、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK）通路,以及刺激激活蛋白-1(AP-1）復合體的形成,完成對 MMPs和 TIMPs基因表達的調控功能。目前未見 TGF-β對血管內皮細胞 MMPs和 TIMPs調控的報道,本課題在觀察 MMP-2表達的同時,檢測 TGF-β在血管內皮細胞內的蛋白表達,實驗結果表明,血脈通 2號中高劑量組和陽性組TGF-β、MMP-2表達水平下降,與模型組相比有顯著性意義,兩者均呈現逐漸下降趨勢。

血脈通 2號顆粒以“補腎益精、泄濁化瘀”為則立方,是治療動脈粥樣硬化的經驗方。本實驗觀察到該方對影響 MMP-2分泌的 EMMPRIN、TGF-β產生了抑制作用,對 MMP-2在血管內皮細胞內的表達有抑制作用,推測是通過影響其相關因子進而抑制 MMP-2的表達,此為中藥復方制劑的綜合作用,具體是復方中什么藥物或成分有抑制 MMP-2的作用,目前尚未見相關報道,須進一步研究以明確。

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血脈通 /藥效學 大鼠 實驗研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0101-03

*江蘇省常州市科技局基金項目(CS20092026）

(收稿 2010-07-30;修回 2010-09-01）