山葡萄核心種質初步構建1)

溫景輝 申海林 鄒利人 陳 蕾 劉洪章

(吉林農業大學，長春，130118) (吉林省農業科學院) (吉林農業大學)

山葡萄核心種質初步構建1)

溫景輝 申海林 鄒利人 陳 蕾 劉洪章

(吉林農業大學，長春，130118) (吉林省農業科學院) (吉林農業大學)

采用擴增穩定且譜帶清晰的18對SSR引物，對360份山葡萄資源進行遺傳多樣性分析。用逐級壓縮法選擇核心種質，比較了樣本數不同的5個核心樣本群的等位基因數、等位基因頻率、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s信息指數等參數，最終選擇了79個樣本組成的樣本群作為核心種質。用DPS軟件對初始種質和核心種質群體的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s信息指數分別作t測驗，核心種質保留了初始種質21.9％的樣品，等位基因數、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數的保留率分別為94.1％、106.3％、101.9％、102.2％，核心種質能很好地代表初始種質。

山葡萄(Vitis amurensis Rupr.);種質資源;遺傳多樣性;SSR;核心種質

植物遺傳資源是新品種選育和種質創新的基礎，種質資源的收集、保存、評價和利用非常重要[1-2]。Hintum 等[3]認為核心種質庫能以最少的種質材料代表一個種及野生近緣種的形態特征、地理分布、基因與基因型最大范圍的遺傳多樣性，可作為有利基因挖掘、新技術應用和資源深入研究的優先樣品集，能夠提高種質資源的利用效率。然而，數量龐大的種質資源不便于優良種質的保存、評價和利用，尤其是多年生木本果樹植物，個體占用土地面積較大、管理費用較高，不便于種質資源的有效管理和深入研究。

DNA分子標記數據能夠直接反映出DNA序列水平上的變化，具有多態性高、不受環境影響和基因表達與否的限制等特點，近年來逐漸成為檢測植物種質遺傳多樣性、構建高質量核心種質的有效特征數據。目前已在芝麻[4-5]、水稻[6]、大豆[7]、豌豆[8]、桃[9]、果梅[10]等植物上建立了核心種質，但利用分子標記技術對我國山葡萄資源進行核心種質構建鮮有報道。筆者以中國農科院左家特產研究所的國家山葡萄資源圃現存的360份山葡萄資源為材料，采用SSR分子標記技術，初步構建了山葡萄種質資源核心種質，旨在為今后山葡萄種質資源的開發利用和遺傳育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試山葡萄資源360份由中國農業科學院特產研究所國家果樹種質山葡萄資源圃提供。

1.2 分子標記方法

采用SSR方法進行遺傳多樣性分析。SSR標記技術見文獻[11]。引物序列由東北林業大學提供，上海生工合成。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚類分析采用Ntsys統計軟件，數據處理采用EXCEL電子表格。每個標記位點，以1和0記錄等位基因的有和無。

1.3 核心種質的遺傳多樣性評價參數

選擇等位基因數、等位基因頻率(pi)、有效等位基因數(A)、Nei’s遺傳多樣性(H)、Shannon’s多樣性信息指數(I)等指標評價核心種質的遺傳多樣性[11]。

1.4 核心種質構建方法

本試驗采用多次聚類結合優先取樣法，其具體原理如下:首先判斷處于最低分類水平的每組兩個遺傳材料的性狀是否具有極端表現，并優先選取具有極端表現的個體。如果兩個體性狀都具有極端表現，則兩個個體都被優先選入核心庫，如果都不具有極端的表現則采用隨機取樣的方法剔除其中一個。對資源多次聚類，采用逐級壓縮方法，建立樣本群，直到代表性或核心種質達到要求，組成核心群體。

用上述方法分別抽取292、204、134、79、53個樣品組成核心樣本群進行分析比較，樣品群代號分別為1、2、3、4、5。

1.5 核心種質數據分析

將從SSR標記中得到的原始數據輸入計算機，通過EXCEL電子表格計算各樣本群的等位基因數、等位基因頻率、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性和 Shannon’s信息指數，并用DPS(v7.05版)軟件對所得數據進行t測驗。

2 結果與分析

2.1 各樣本群的遺傳多樣性比較

根據評價遺傳多樣性公式，采用EXCEL電子表格計算得出了各樣本群的等位基因數、等位基因保留率、等位基因頻率、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數，結果見表1。比較不同取樣數目所獲得的各種遺傳參數，可知樣本群4代表的79份樣品除等位基因頻率低于樣本群5外，有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性和 Shannon’s信息指數都是最高的，應把79份樣本作為核心種質。

表1 各樣本群的遺傳多樣性比較

2.2 初始種質與核心種質比較

初始種質與核心種質的等位基因數、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數，結果見表2。從表2可看出核心種質保留了初始種質21.9％的樣品，等位基因數、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數的保留率分別為94.1％、106.3％、101.9％、102.2％。

表2 核心種質與初始種質遺傳多樣性比較

用DPS軟件對2個群體的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數分別作t測驗，結果見表3。可以看出核心種質的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數在概率0.05水平上與初始種質差異不顯著，可見核心種質能很好的代表初始種質群體基因型值的多樣性。

表3 初始種質與核心種質t測驗結果

2.3 保留種質與核心種質比較

保留種質即原始種質除去核心種質后保留下來的種質資源，這部分種質作為后備資源，當在核心種質中無法找到所需性狀時，就可從保留種質中尋找。核心種質與保留種質的等位基因數、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數，結果見表4。

表4 核心種質與保留種質遺傳多樣性對比

用DPS軟件對核心種質和保留種質的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數分別做t測驗，結果如表5。可以看出，在概率0.05水平上核心種質的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性和Shannon’s信息指數與保留種質差異不顯著。但從表4可知核心種質的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數均高于保留種質，應該優先使用。

表5 核心種質與保留種質t測驗結果

2.4 山葡萄資源核心種質主要性狀

79份核心種質中包含兩性花、雌能花和雄株3個類群。其中兩性花31份，占兩性花樣本的21.7％;雌能花46份，占雌能花樣本的21.7％;雄株2份，占雄株樣本的40％。

3 討論

3.1 核心種質的代表性、異質性和多樣性

構建核心種質時要選擇有代表性、異質性和多樣性、類型齊全的樣本作為核心種質。本研究采用SSR標記方法構建的核心種質中，不僅包含野生資源、人工培育品種(系)2大類，而且包含某些特殊性狀的種質，如除兩性花外，還有雌能花和雄株等。初始種質與核心種質相比，有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數分別經t測驗差異不顯著;同時，核心種質的有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數也均高于保留種質。這說明所構建的79份核心種質是山葡萄資源遺傳多樣性很高的種群，具有很好的代表性。

3.2 核心種質的構建方法

以往核心種質的構建多采用形態學方法[4-8]構建，形態農藝性狀數據作為研究核心樣品的指標，有簡便和研究費用低的優點，但易受環境和基因顯隱性的影響。自分子標記廣泛應用于植物遺傳資源研究以來，RFLP、RAPD、AFLP、SSR等標記已經逐漸成為評價植物資源多樣性、構建核心種質的有效方法。本研究運用SSR標記，成功地初步構建了360份山葡萄資源的核心種質，具有一定應用價值。分子標記能從DNA水平檢測材料的遺傳差異，但分子標記不是直接控制形態一農藝性狀變異的基因，僅用分子標記研究核心種質也存在著不足。如何整合這兩類數據構建核心種質是核心種質研究中仍需解決的問題。

3.3 核心種質的取樣比例

在國內外不同植物核心種質庫的構建中總體取樣比例為該物種總資源的5％～30％，或總量不超過3 000份[12]。由于生物進化及人工選擇對作物的干預，產生了各個物種獨特的特性，對整體取樣比例的確定不能格式化、簡單化，應視研究作物的遺傳結構及遺傳多樣性而定。目前，在已構建的多種果樹資源核心種質的取樣比例均較高，取樣比例為10％～30％。其中，張春雨[13]利用SSR標記構建的新疆野蘋果核心資源取樣比例為22.9％，劉勇[14]等構建的柚類核心資源取樣比例為22.73％，程麗莉[15]構建的燕山地區實生板栗核心種質取樣比例為27.2％，高志紅[16]構建的果梅核心資源取樣比例為10％，馬玉敏[17]構建的野生板栗核心資源取樣比例為20％。在本研究中，通過采用SSR分子標記，經過遺傳多樣性評價和顯著性t測驗，確定了我國山葡萄資源核心種質合適的取樣比例為初始種質的21.9％。

4 結論

采用SSR分子標記，選擇組內聚類逐步壓縮取樣方法，對360份山葡萄資源進行核心種質構建，獲得了包含79份資源的核心種質。核心種質保留了初始種質21.9％的樣品，等位基因數、有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性、Shannon’s信息指數的保留率分別為94.1％、106.3％、101.9％、102.2％，核心種質能很好的代表初始種質群。

致謝:感謝中國農科院特產研究所提供試驗材料及農藝性狀數據，感謝中國農業大學王軍教授提供引物序列，特此致謝。

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Primary Establishment of Core Collection of Vitis amurensis in Northeast China

/Wen Jinghui(School of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，P.R.China);Shen Hailin，Zou Liren，Chen Lei(Jilin Academy of Agricultural Sciences);Liu Hongzhang(Jilin Agricultural University)//Journal of Northeast Forestry University.-2011，39(6).-35～37

Vitis amurensis;Germplasm resources;Genetic diversities;SSR;Core collections

S663.1

1)現代農業產業技術體系建設專項資金資助(nycytx-30)。

溫景輝，男，1963年10月生，吉林農業大學生命科學學院，博士研究生，工作于吉林省農業科學院，研究員。

劉洪章，吉林農業大學生命科學學院，教授。E-mail:lhz999@126.com。

2010年12月17日。

責任編輯:戴芳天。

Eighteen pairs of SSR primers with steady amplification and clear spectrum were used to analyze the genetic diversity of 360 accessions of Vitis amurensis Rupr.in northeast China.Stepwise condensation method was used to screen the core collection.A total of 79 samples were chosen as core collection by comparing the parameters of 6 sample groups，including number of alleles，allele frequency，effective number of alleles，Nei’s genetic diversity，and Shannon information index.T-test for initial collection and core collection was performed by using DPS software.Results showed that the core collection hold 21.9 percent of samples of initial collection，and the number of alleles，the effective number of alleles，Nei’s genetic diversity，and Shannon information index reached 94.1％，106.3％，101.9％and 102.2％respectively.It is demonstrated that the core collection can express initial collection well.