小鼠骨髓干細(xì)胞移植對(duì)生殖細(xì)胞生成的影響△

陜西省人民醫(yī)院泌尿外科(西安 710068) 程永毅 孫 羿 徐永剛 時(shí) 亮

小鼠骨髓干細(xì)胞移植對(duì)生殖細(xì)胞生成的影響△

陜西省人民醫(yī)院泌尿外科(西安 710068) 程永毅 孫 羿 徐永剛 時(shí) 亮

目的:探討綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓干細(xì)胞移植對(duì)不育模型小鼠生殖細(xì)胞的影響。方法:用白消安造小鼠無精子癥模型,將綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞處理后移植到無精子癥模型小鼠睪丸網(wǎng)內(nèi),在小鼠分組干預(yù)后用Western-Blot方法檢測各組小鼠睪丸VASA基因表達(dá)水平。結(jié)果:模型鼠睪丸病理切片顯示睪丸曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞顯著減少(P＜0.05),Western-Blot結(jié)果顯示 VASA基因蛋白水平較正常鼠顯著降低(P＜0.05)移植成功組小鼠VASA基因蛋白表達(dá)水平較模型對(duì)照組高(P＜0.05),但仍低于正常鼠水平。結(jié)論:①含骨髓干細(xì)胞的骨髓混合細(xì)胞移植到無精子癥模型小鼠睪丸網(wǎng)內(nèi),可明顯促進(jìn)生殖細(xì)胞生成。②VASA基因表達(dá)水平可作為睪丸性不育動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)。

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞,具有無限分裂能力。骨髓含有造血干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞,內(nèi)皮干細(xì)胞,多能成人祖細(xì)胞,而骨髓移植技術(shù)早已成為臨床上非常成熟的治療技術(shù)[1]。已經(jīng)有研究證實(shí),骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞可分化成骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱組織、肝臟、心肌、腎臟、神經(jīng)細(xì)胞[2,3],生殖細(xì)胞[4～6],間質(zhì)細(xì)胞[5,6],而且還可以分化成支持細(xì)胞[6]。本研究旨在通過將含有干細(xì)胞的骨髓混合細(xì)胞移植入無精子癥模型鼠的睪丸內(nèi),檢測生殖細(xì)胞標(biāo)志物V ASA基因蛋白的表達(dá)水平,觀察骨髓干細(xì)胞移植對(duì)模型鼠睪丸生殖細(xì)胞的影響。

材料與方法

1 動(dòng)物與試劑

1.1 動(dòng)物與分組 4周齡雄性ICR小鼠200只,購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。隨機(jī)選取30只作為空白對(duì)照組,不參與造模與移植,正常條件飼養(yǎng) 14周后檢測標(biāo)本;剩余 170只小鼠用白消安造模,飼養(yǎng) 4周后存活小鼠中隨機(jī)選取 30只作為模型評(píng)價(jià)組,評(píng)價(jià)模型效果;剩余存活造模鼠中隨機(jī)選取 30只小鼠作為模型恢復(fù)組,不參與移植正常飼養(yǎng),再飼養(yǎng) 10周后存活小鼠檢測標(biāo)本。最后剩余小鼠全部參與移植,移植后10周存活小鼠分批處死,存活小鼠取睪丸檢測標(biāo)本,判定移植成功的睪丸為移植成功組,移植成功組小鼠非移植側(cè)睪丸為移植陰性對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 白消安購于西格瑪奧德里奇公司,純度為99.99%。DM SO購于西格瑪奧德里奇公司。

2 模型制備 將白消安配成2%DMSO水溶液,37℃水浴箱內(nèi)水浴,防止藥物沉淀,將小鼠稱重,按50mg/kg劑量腹腔單次注射白消安溶液,正常飼養(yǎng) 4周后用于移植。造模4周后隨機(jī)抽取 30只模型鼠,一側(cè)睪丸常規(guī) HE切片,另一側(cè)睪丸用W estern-Blot方法檢測睪丸細(xì)胞VASA基因表達(dá)水平。

3 供體細(xì)胞制備

3.1 供體小鼠 GFP轉(zhuǎn)基因雄性小鼠,購于第四醫(yī)大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所。

3.2 細(xì)胞制備 無精子癥模型造好后,處死GFP轉(zhuǎn)基因小鼠,在無菌臺(tái)上解剖開股骨和脛骨,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(p H 7.4)沖洗,沖洗液在 600 r/min離心分離 5min后細(xì)胞沉淀,然后在 34°C去鎂去鈣的Hanks平衡鹽溶液中緩慢消化,形成含有0.05μg/m l膠原蛋白酶;0.05 mg/m l DNA酶和 0.025%胰蛋白酶的單細(xì)胞懸液。之后加入胰蛋白酶抑制劑,離心,用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Du lbecco’smodified eagle medium)洗滌,細(xì)胞計(jì)數(shù),600 r/min離心 5min后細(xì)胞沉淀,用 0.04%臺(tái)盼藍(lán)染色劑(Trypan blue stain)混懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度為 (5～ 15)× 104/m l。

4 移 植

4.1 移植器械 20-μl玻璃微量吸管,帶一個(gè)移液管吸頭。每個(gè)移液管口都用微型砂輪磨成斜面尖端,形成微注射器。

4.2 移植步驟 移植方法參照文獻(xiàn)[6,9]略作修改。用無菌的30號(hào)計(jì)量注射針在與睪丸連接的傳入束上刺一小口23mm,微移液管尖端插入傳入束,輕輕向前推向睪丸網(wǎng),當(dāng)尖端進(jìn)入網(wǎng)狀區(qū),恒壓下推入 10μl細(xì)胞懸液。

5 移植成功的判定標(biāo)準(zhǔn) 移植后10～ 12周分批處死小鼠,右側(cè)睪丸(非移植側(cè))沿長軸縱行剖開,一半立即檢測 VASA基因表達(dá)水平,剩余標(biāo)本用 4%多聚甲醛固定做 HE染色病理切片;左側(cè)(移植側(cè))睪丸沿長軸縱行剖開成兩半,其中一半迅速制成細(xì)胞懸液,在倒置熒光顯微鏡下觀察,以找到顯示綠色熒光的完整細(xì)胞作為移植成功的判定依據(jù),有完整的熒光細(xì)胞表明移植成功(見圖 1～2),剩余半部分睪丸再沿長軸剖成各四分之一大小,其中一部分制病理切片,其余部分用 W estern-Blot法檢測VASA基因表達(dá)水平,否則判定移植不成功,舍棄該標(biāo)本。

圖 1 普通光鏡下組織懸液,含有較小組織碎片

圖2 熒光鏡下可見明顯的GFP陽性細(xì)胞及較小組織碎片

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將各組小鼠睪丸 Western-Blot檢測結(jié)果用 Bandscan軟件分析后形成數(shù)據(jù),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P＜0.05為有顯著性差異,以P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 病理檢測 見圖3～ 6。空白對(duì)照組曲細(xì)精管顯示正常形態(tài),各級(jí)細(xì)胞排列有序;模型評(píng)價(jià)組曲細(xì)精管細(xì)胞層次顯著變少,失去正常生精上皮結(jié)構(gòu),精母細(xì)胞和精細(xì)胞消失,與空白對(duì)照組差異明顯;模型恢復(fù)組曲細(xì)精管生精上皮有所恢復(fù),但仍未及正常水平,多數(shù)標(biāo)本顯示生精細(xì)胞層次紊亂;移植成功組曲細(xì)精管生精上皮結(jié)構(gòu)均有不同程度恢復(fù)但仍未達(dá)到正常水平。

圖 3 空白對(duì)照組小鼠曲細(xì)精管,可見生殖細(xì)胞層次有序

圖 4 模型評(píng)價(jià)組曲細(xì)精管,各級(jí)生殖細(xì)胞消失,支持細(xì)胞空泡樣變性

2 VASA基因表達(dá) 見圖 7。各組小鼠睪丸VASA基因蛋白 W estern-Blot條帶,以空白對(duì)照組VASA基因表達(dá)數(shù)據(jù)均值為基準(zhǔn),設(shè)為 1,空白對(duì)照組(30只 )為 1.000± 0.009,模型評(píng)價(jià)組 (30只 )為 0.082± 0.031,模型恢復(fù)組 (28只 )為 0.313± 0.037,移植成功組(17個(gè)睪丸)為 0.795±0.233,移植陰性對(duì)照組(17個(gè)睪丸)為 0.326±0.035。空白對(duì)照組VASA基因表達(dá)水平最高,顯示了正常小鼠睪丸VASA基因的表達(dá)水平。模型評(píng)價(jià)組VASA基因表達(dá)水平最低,模型恢復(fù)組較模型評(píng)價(jià)組高,提示了模型自然恢復(fù)的效果,移植成功組數(shù)據(jù)較模型恢復(fù)組明顯高(P＜0.01),提示了移植成功組的效果,但仍較空白對(duì)照組低。移植陰性對(duì)照組和模型恢復(fù)組數(shù)據(jù)非常接近。

圖 5 模型恢復(fù)組曲細(xì)精管,生殖細(xì)胞有所恢復(fù)

圖 6 移植成功組曲細(xì)精管,可見生殖細(xì)胞明顯恢復(fù)

圖 7 各組小鼠睪丸V ASA基因表達(dá)條帶示例 0為內(nèi)參GAPDH,1為空白對(duì)照組,2為模型評(píng)價(jià)組,3為模型恢復(fù)組,4為移植陰性對(duì)照組,5為移植成功組

討 論

骨髓干細(xì)胞有多樣分化潛能,目前的研究均發(fā)現(xiàn)不同的外環(huán)境可決定干細(xì)胞的分化方向,但骨髓干細(xì)胞的分化機(jī)制及調(diào)控機(jī)制尚無公認(rèn)的突破性研究。干細(xì)胞移植本身改變了干細(xì)胞的外環(huán)境,即對(duì)干細(xì)胞分化產(chǎn)生調(diào)控。而干細(xì)胞移植在多種動(dòng)物模型中均產(chǎn)生了不同程度的修復(fù)作用[2],具體機(jī)制目前尚不清楚。本組將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞移植到模型鼠睪丸,10～12周后在熒光顯微鏡下睪丸細(xì)胞懸液中成功發(fā)現(xiàn)17例標(biāo)本內(nèi)含有GFP陽性的細(xì)胞,可證實(shí)供體骨髓細(xì)胞在受體內(nèi)存活。這與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道[6]相一致。本組實(shí)驗(yàn)證實(shí)含干細(xì)胞的骨髓混合細(xì)胞移植,可明顯促進(jìn)模型鼠生殖細(xì)胞生成。我們?cè)谘芯恐型ㄟ^小鼠移植成功側(cè)睪丸,未移植側(cè)睪丸及模型對(duì)照組小鼠睪丸的對(duì)照,明確證實(shí)移植成功的睪丸內(nèi) VASA蛋白表達(dá)水平較未移植側(cè)及模型對(duì)照組明顯高。同時(shí)未移植側(cè)睪丸與模型對(duì)照組小鼠睪丸的VASA表達(dá)水平無顯著性差異。

關(guān)于本研究的分組,我們特別將移植鼠的左側(cè)睪丸移植,右側(cè)睪丸不移植,作為對(duì)照組。理論上,移植側(cè)的細(xì)胞無法經(jīng)過血液循環(huán)到達(dá)非移植側(cè),但是移植這個(gè)干預(yù)措施是否會(huì)通過受體鼠自身的免疫反應(yīng)或某些細(xì)胞因子而對(duì)非移植側(cè)睪丸的精子發(fā)生產(chǎn)生影響?本組實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)移植操作對(duì)非移植側(cè)睪丸產(chǎn)生明確影響,證實(shí)移植成功后睪丸內(nèi)發(fā)生的變化是由移植的供體細(xì)胞產(chǎn)生的。

用V ASA蛋白表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)白消安無精子癥模型成功的指標(biāo)。無論用何種藥物及方法制造無精子癥模型,最終目標(biāo)都是清除內(nèi)源性的精子發(fā)生。而精原細(xì)胞、各級(jí)精母細(xì)胞以及精子等是人類及模型動(dòng)物睪丸內(nèi)惟一表達(dá)VASA蛋白的生殖細(xì)胞[7～8]。因此,可用V ASA蛋白表達(dá)水平衡量無精子癥動(dòng)物模型體內(nèi)生殖細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。而白消安可明顯損傷生殖細(xì)胞,造成曲細(xì)精管生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)及層次的破壞,明顯減少生殖細(xì)胞的數(shù)量,因此,可用 VASA蛋白表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)白消安無精子癥模型成功與否的指標(biāo)。

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骨髓祖代細(xì)胞 /移植 生殖細(xì)胞 /病理生理學(xué) 基因 /代謝 模型,動(dòng)物 小鼠

R734.2

A

1000-7377(2011)01-0026-04

△陜西省科技廳 2006K15-G4

(收稿:2010-09-30)