16α，17α-環氧黃體酮C11β-羥基化微生物的選育

吳定偉 王麗婭 陳小龍 萬建峰

（1浙江仙琚制藥股份有限公司，浙江 仙居 317300；2浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江 杭州 310014；3浙江經貿職業技術學院應用工程系，浙江 杭州 310018）

甾體類化合物都具有環戊烷并多氫菲結構，常見的如甾體激素黃體酮、睪酮，以及內源性物質膽固醇［1］。人們對甾體化合物的研究已經開展數十年，發現其對糖代謝、脂肪代謝、蛋白質合成、礦物質合成以及性功能和神經調節等都具有重要的生理功能，目前已經有幾十種上市的甾體藥物，其治療領域包括抗炎、抗過敏、降壓、避孕、增強抵抗力和抗腫瘤等［2-3］。

在上市的甾體藥物中，糖皮質激素類藥物臨床應用最為廣泛，是最為重要的甾體類藥物。它們具有強大的抗炎活性，適用于各種炎癥，過敏性疾病和休克等危重疾病，其結構中11-β羥基是化合物產生抗炎活性的關鍵藥效片段。由于甾體結構的特點，采用化學方法進行11-β羥基化反應費時、費力，且很難保證11位羥基的β構型。而采用微生物轉化法卻能選擇性的在甾體的11位引入羥基，迄今為止，已經相繼發現具有甾體羥化作用的細菌、放線菌、真菌、霉菌等。其中國內大多數甾體生產企業采用藍色犁頭霉進行11-羥化反應，但是仍存在選擇性較差，易產生11-α羥化產物以及其他位置羥化產物，收率在45％左右［4-6］。另外也有文獻報道采用新月彎孢霉、黑根霉等菌種進行微生物轉化，收率也僅有一定幅度的提高，達到50％左右。因此，有必要進一步對多個菌種進行篩選和培育，力求獲得高效11β-羥基化沃氏氧化物的微生物菌株。本論文采用紫外誘變、低能氮離子注入誘變和鈷-60誘變這3種國內外常用方法對菌種施行多樣化的選育操作［7-10］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

雅致小克銀漢霉Cunningnamella elegans（編號40250），購自北京微生物菌種保藏中心，其他菌種均來自浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.1.2 基礎培養基

葡萄糖3％，玉米漿3.5％，（NH4）2SO40.5％，酵母粉0.25％，玉米油0.1％。

1.1.3 主要設備和試劑

高效液相色譜儀，日本島津公司生產的LC-10A。鈷-60誘變在浙江省農科院進行。低能氮離子注入誘變在浙江工業大學進行。沃氏氧化物、11β-羥基-16α，17α-環氧孕酮和11α-羥基-16α，17α-環氧孕酮霉菌氧化物由浙江仙琚制藥股份有限公司提供。高效液相色譜用甲醇和乙腈為色譜級，其他試劑均為分析純。

1.2 分析方法

1.2.1 菌懸液的pH測定及菌體重量測定

將矯正好的pH電極放入被測菌懸液中，等讀數穩定后讀取顯示器上的數字即為該菌液的pH值。將搖床培養48h后的菌懸液抽濾，稱量菌體重量，記為W濕，然后將其放入烘箱里烘至恒重，取出稱量記為W干。

1.2.2 轉化底物和產物檢測

采用HPLC法分析轉化底物和產物。色譜條件：C18反相色譜柱，流動相：乙腈：水=60：40，檢測波長：245nm，流速：1.5mL/min，進樣量：10μL。

1.3 實驗方法

1.3.1 土豆培養基和基礎培養基的配制

斜面培養基：PDA培養基。基礎培養基：葡萄糖3％、玉米漿3％、（NH4）2SO40.5％、酵母粉0.25％，FeSO40.01％和玉米油0.1％，培養基經121℃滅菌20min，備用。

1.3.2 菌種活化

菌種轉接到PDA斜面，在28℃下培養3d。

1.3.3 底物投料

稱取6g沃氏氧化物，3.6g β-環糊精及少量吐溫80，溶于60mL的水中，在加熱條件下充分攪拌。用移液管吸取5mL的底物溶液加入已經培養22h的搖瓶中，繼續培養48h進行羥化反應。

1.3.4 發酵液的預處理將發酵轉化后得到的發酵液混合物先測其pH值，然后過濾去除上清液，取0.1g濕菌絲體，其余稱量濕重W濕，然后放入烘箱里80℃下干燥并稱其重W干。在0.1g濕菌絲體中用5mL的乙酸乙酯在密封條件下萃取30min。離心后取萃取液1mL于EP管中，用吹風機吹干，再加入1mL的分析純甲醇，震蕩溶解5min，冰箱保存待檢測。

1.3.5 誘變方法

1.3.5.1 紫外誘變

將200μL菌懸液（或加入底物）接入培養皿，啟動磁力攪拌器，使用20W功率紫外燈管，照射距離為15cm。實驗誘變時間分別設定為30s和60s，處理過程在暗室操作。處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用密封紙盒包起來培養，最后放入25℃恒溫培養箱內培養2～3d，期間觀察菌體長勢，然后再進行分離篩選。

1.3.5.2 低能氮離子注入誘變

吸取200μL的孢子液涂到無菌玻璃平皿上，同時用一個平皿進行真空處理對照，另一個平皿做外環境對照。用涂棒涂勻，放在無菌操作臺上吹干后，再置于離子束裝置靶室，分別用20keV的氮離子（N+）照射處理，劑量為90s、120s、150s（離子束單位為×2.6×1013ions/cm2·s），選取大劑量240s和300s做參照。

1.3.5.3 鈷-60誘變

選定5個照射的劑量：1000，1200，1400，1600和1800keV進行Co-60誘變，將誘變的菌懸液稀釋成5個梯度，稀釋后的菌懸液注入25個培養皿中，使用土豆培養基，最后放入恒溫箱內培養。

2 結果與討論

2.1不同微生物菌株轉化能力的比較

表1 不同微生物菌株轉化能力的比較

從表1中可以發現S 418黑根霉發酵產物中不含有11β-沃氏物，而11α-沃氏物的含量很高，結果與文獻數據相符，驗證了S 418黑根霉能提高產物11α位點的轉化率，11β位點基本不發生反應。新月彎孢霉X1和X2的發酵產物中都不含有11β-沃氏物，這與國外的研究成果不相符，通過觀察活化的菌種發現其形態和顏色與文獻中的描述不相同（重復活化情況仍相同），懷疑菌種可能已經退化或者染菌，后期實驗放棄使用。藍色犁頭霉D1、D2、D5的底物轉化率偏低，同時產物中不含有11β-沃氏物，藍色犁頭霉和銀漢霉的發酵產物與其他5種菌相比含11β-沃氏物但含量偏低。

2.2 紫外誘變育種

表2 紫外誘變藍色犁頭霉

表2顯示轉化率沒有明顯的提高，致死率基本都達到了90％以上，可能是照射時間不夠，只有2個菌株的產率高于初始數據，正變率為16.7％，產量提升僅為15％。

表3 紫外誘變銀漢霉

而表3中顯示轉化率有一定波動幅度，一些產率提高了20％，在大劑量240s均發現產率出現了下降，采用相同方式再進行一次操作得出類似的結果。表明在大劑量誘變的情況下，正突變頻率并沒有增加，正變率僅為8.7％，同時產率浮動較大。通過多次的誘變發現，銀漢霉的誘變菌株相比藍色犁頭霉誘變株產率提升較大，但是11β-沃氏物含量仍然停留在5％左右，與文獻中40％～45％的轉化率有很大差距。如果進一步增加照射時間有又會對菌種造成損害，同時也無法保證產率能獲得質的提升。

2.3 低能氮離子注入誘變育種

從表4可看出，在20keV的能量、90s～150s的劑量范圍內，銀漢霉的致死率并沒有一直隨著照射劑量的增加而上升，而是隨著氮離子（N+）照射劑量的加大先增大后降低，同期實驗獲得的結果相同，這是因為用離子束照射處理微生物可能產生先降后升再降的"馬鞍型"存活曲線。從表中可以看出，菌種誘變結果大部分為正常范圍或正變，產率提高了20％～40％，正變率達15.6％。通過加大劑量又會導致菌體無法生長，選擇在低劑量的范圍比較合適，在20keV的能量下，劑量90s和120s時的正變率最高，最高含量達到5.8％。

表4 低能氮離子注入誘變銀漢霉

2.4 鈷-60誘變育種

表5 鈷-60誘變銀漢霉

從表5中看出，菌種誘變結果大部分為正常范圍或負變，正變率依舊為0。隨著照射劑量的增加產率并沒有明顯的變化，同時獲得的單菌落數量偏少。考慮Co-60誘變是一種破壞性較強的誘變過程，在照射時對銀漢霉菌體造成了不可恢復的影響。

4 結論

以保藏菌株土曲霉藍色梨頭霉（Absidia coerulea）40302和雅致小克銀漢霉（Cunni ngnamella elegans）40250為出發菌株，經等離子注入、紫外線、Co-60等方法對菌種進行篩選。通過比對4種實驗方法發現，化學誘變方法與Co-60誘變導致菌體發生負突變的幾率較大，經紫外誘變處理后的結果基本處于正常范圍，等離子注入誘變的正突變率最高。經等離子注入誘變處理篩選后，條件為照射劑量20keV，照射時間90s，獲得一株性能穩定的銀漢霉突變株，28℃搖瓶發酵22h，48h后投料，C11β-羥基-16α，17α-環氧孕酮的轉化率達到5.8％，相比最初的轉化率提高了30％。說明采用等離子注入誘變方法是有效的。

［1］Wu J P，Pan B X，Yuan F.Intraarticular Injection with Diprospan in Treating the Rheumatoid Arthritis［J］.Clin Med Engin，2010，17（2）：113-114.

［2］Lotti T，Buqqiani G，Troiano M，et al.Targeted and combination treatments for vitiligo Comparative evaluation of different currentmodalities in 458 subjects［J］.Dermatol Ther，2008，21（1）：20-26.

［3］Arthan D，SvastiJ，Kittakoop P，etal.Antiviral isoflavonodisulfate and steroidal glycosides from the fruits of Solanum turvum［J］.Phytochemistry，2002，59：459-63.

［4］張天智，楊炯，楊順楷，等.微生物轉化在甾體激素工業生產中的應用［J］.工業微生物，1987，17（1）：26-33.

［5］曾本秀，陳樹群，陳伯林.提高甾體微生物11β-羥基化的酶活性［J］.中國醫藥工業雜志，1993，24（12）：529-532.

［6］林新國，周才賦.梨頭霉菌生產11β-羥基化化合物RS-21醋酸酯的研究［J］.化學反應工程工藝，1995，11（2）：213-216.

［7］黃淑惠，徐詩偉，法幼華.用新月彎飽霉11β-羚基化16a-甲基化合物RS-21-醋酸酯［J］.微生物學報，1989，29（1）：68-71.

［8］Chen K，Tong W Y，Wei D Z，et al.The 11βhydroxylation of 16，17α-epoxy progesterone and the purification of the 11β-hydroxylase from Absidia coerulea IBL02［J］.East China University of Science and Technology，2004，1：46-78.

［9］王敏，路福平，蔣岳，等.新月彎飽霉原生質體的形成與11β-羥基化反應［J］.微生物學雜志，2000，20（3）：36-37.

［10］杜連祥，王敏，王賡，等.轉化RSA為氫化可的松的新月彎抱霉篩選［J］.微生物學通報，2001，28（1）：44-48.