有機物料腐熟劑中纖維素酶活力測定方法的驗證

吳紅艷,王智學,陳 飛,郭玲玲,修翠娟

(遼寧省微生物科學研究院,遼寧朝陽 122000)

纖維素是所有植物的主要組分,由于纖維素中存在很多高能的氫鍵,因此其水解、利用困難,大部分難以被人類或動物所直接利用。有機物料腐熟劑是一種能加速各種有機物料(包括農作物秸稈、畜禽糞便、生活垃圾及城市污泥等)分解、腐熟的微生物活體制劑[1],其中含有數量較多的可以產生纖維素酶的微生物。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱,不同來源的纖維素酶其組成及各組分比例有較大差異,同時纖維素酶作用的底物也比較復雜,致使纖維素酶活力的測定方法很多,且方法復雜而不統一。常用的方法有CMC糖化力法、CMC液化力法、濾紙糖化力法、濾紙崩潰法和棉花糖化力法等。國內許多學者分別采用了以上各種方法[2]并進行了種種修改,這不僅使得纖維素酶活力測定的方法多樣化,也造成了不同產品、不同結果之間無法相互比較。在上述測定方法中,CMC糖化力主要代表外切β-1,4葡聚糖苷酶和內切酶的活力總和[3],在研究和實際生產中應用比較普遍。為了測定此有機物料腐熟劑中纖維素酶的活力,制定科學的檢測依據,本文對所采用的方法(即改進后的CMC糖化力測定法[4])進行了驗證,使采用的方法適合于相應檢測要求。驗證的主要內容[5]:準確度(加樣回收率)、線性(線性回歸方程)、精密度和重復性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 有機物料腐熟劑由遼寧省微生物科學研究院提供。

1.1.2 試劑 3,5-二硝基水楊酸(DNS)、羧甲基纖維素鈉(CMC)、葡萄糖、醋酸鈉、醋酸,均為分析純。

1.1.1 儀器 723型分光光度計,恒溫水浴鍋,萬分之一分析天平,具塞刻度試管,移液管等。

1.2 方法

1.2.1 原理[6]纖維素酶能促使纖維素斷裂成低聚纖維素,直至分解成寡糖和單糖。利用一定條件下單位時間內羧甲基纖維素鈉在酶的作用下,生成還原糖的量來表示纖維素酶的活力。還原糖與3,5-二硝基水楊酸(DNS)發生顏色反應,因此,可利用分光光度計進行比色,測定出其活力。酶活力定義:1 g固體樣品,在50℃、pH 4.4的條件下,1 min內分解羧甲基纖維素鈉產生1 μg葡萄糖,即為1個酶活力單位,以u/g表示。

1.2.2 溶液配制 ①0.1%標準葡萄糖溶液:精確稱取已恒重的葡萄糖0.1 g,用水溶解并定容至100 mL容量瓶中;②0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.4):甲液(0.1 mol/L醋酸鈉溶液):精確稱取0.42 g醋酸鈉溶于50 mL蒸餾水中;乙液(0.1 mol/L醋酸溶液):吸取2 mL醋酸溶液用水稀釋至120 mL。取甲液39 mL,乙液61 mL混合即可;③3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS顯色劑):稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸溶解于蒸餾水中,加入20 g氫氧化鈉、182 g酒石酸甲鈉,加蒸餾水500 mL升溫溶解后加入重蒸酚4 g,無水亞硫酸鈉3 g,加熱攪拌待全部溶解后冷卻,定容至1 000 mL,過濾、貯存于棕色瓶中放置7～15 d后使用;④0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)配制:稱取0.500 0 g羧甲基纖維素鈉溶解于100 mL的0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.4)中,4℃冰箱保存,用前充分搖勻。

1.2.3 供試液制備 精確稱取樣品2～3 g,加入適量的0.1 mol/L醋酸緩沖液,攪拌均勻,于30℃恒溫振蕩提取60 min,8 000 r/min低溫離心10 min,收集上清液,再重復1次,合并上清液即為待測樣品溶液。測定時稀釋至適當倍數。

1.2.4 方法驗證 ①線性關系考察:按表1在比色管中分別加入0.1%標準葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,均用蒸餾水補足0.5 mL,各加入DNS顯色劑3 mL,在沸水浴中顯色10 min,放入冷水中冷卻,定容至10 mL,用10 mm比色皿、波長550 nm,分別測定其吸光度,以不含葡萄糖的1號管為空白。以葡萄糖毫克數為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線考察其線性關系,結果見表1;②準確度(加樣回收率)試驗:精密稱取已知含量的纖維素酶100 mg,置100 mL容量瓶中,加適量0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.4)使其完全溶解后定容,作為對照液。加入已知含量的樣品中,使其濃度分別達到其含量的80%、100%、120%,然后用纖維素酶活力測定方法,測定計算回收率,結果見表2;③重復性試驗:分別稱取5份樣品2～3 g,加入0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.4)溶解并定溶至100 mL,依法測定其含量,結果見表3;④精密度試驗:分別配制高、中、低3個濃度的纖維素酶供試液,各濃度連續測定3次,計算方法的精密度,結果見表4。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察結果

線性關系考察結果見表1。以葡萄糖毫克數為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線,并得出回歸方程:y=1.562 6x-0.018 1。回歸線的相關系數R=0.999 0,R值大于0.998。

表1 標準曲線試驗結果Table 1 The test result of standard curve

2.2 準確度(加樣回收率)試驗結果

準確度(加樣回收率)試驗結果見表2。測得各樣品平均加樣回收率為98.29%,RSD%=0.513 3%(n=9),小于2.0%。

表2 準確度(加樣回收率)試驗結果Table 2 The test result of accuracy(recovery of adding sample)

2.3 重復性試驗結果

重復性試驗結果見表3。測得樣品之間相對標準偏差為0.54%(n=6),小于2.0%。

表3 重復性試驗結果Table 3 The test result of repeatability

2.4 精密度試驗結果

精密度試驗結果見表4。測得樣品之間相對標準偏差為0.39%(n=6),小于2.0%。

表4 精密度試驗結果Table 4 The test result of precision

3 討 論

由本實驗驗證結果可以看出,回歸線的相關系數R=0.999 0大于可接受標準0.998,證明線性關系良好。準確度(加樣回收率)的平均加樣回收率為98.29%,RSD%=0.513 3%(n=9)均符合標準,即各濃度下的平均回收率均應在98.0%～102.0%之間,9個回收率數據的相對標準差(RSD)不大于2.0%。重復性試驗和精密度試驗結果表明,RSD%均小于2%,符合標準。

因此,本測定方法穩定、可靠,可以作為有機物料腐熟劑中纖維素酶活力的測定方法。

[1] 中華人民共和國農業部發布的中華人民共和國農業行業標準提出《有機物料腐熟劑纖維素酶活力測定》[M].2005.

[2] 孔新剛,李華,吳國蓮.秸稈纖維素酶水解率測定方法的研究[J].新疆農業科學,2007,44(5):663-666.

[3] 顧方媛,陳朝銀.纖維素酶的研究進展與發展趨勢[J].微生物學雜志,2008,28(1):83-87.

[4] 張慶華,趙新海,李莉,等.秸稈降解菌的篩選及模擬田間應用效果分析[J].微生物學雜志,2010,30(4):101-104.

[5] 丁恩峰,高海燕,韓志偉.頂空氣相色譜法測定原料藥中正丁醇和乙酸乙酯含量的方法驗證[J].醫藥工程設計,2006,27(4):30-32.

[6] 顧賽紅,趙志輝,陳海燕,等.底物和酶液稀釋對黑曲霉纖維素酶活性測定的影響[J].中國飼料,2006,(7):9-12.