EL ISPOT檢測(cè)人乳頭瘤病毒特異性的記憶T細(xì)胞

王雪蓮,盧 巖,安春麗

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,遼寧沈陽(yáng) 110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院院感科,遼寧沈陽(yáng) 110004)

人乳頭瘤病毒(human papillamavirus,HPV)是一組嗜上皮組織的雙鏈DNA病毒。HPV僅感染局部的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞,不入血,因而外周血中抗原特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量少,抗原特異性記憶T細(xì)胞的數(shù)量更少。本研究收集HPV自發(fā)清除者(病毒清除后74個(gè)月)外周血單個(gè)核細(xì)胞,抗原肽刺激后,采用EL ISPOT方法,檢測(cè)記憶T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力,以明確外周血中記憶T細(xì)胞的數(shù)量和功能。該結(jié)果可為后續(xù)檢測(cè)HPV持續(xù)感染者或?qū)m頸癌患者體內(nèi)抗原特異性的記憶T細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RPM I1640培養(yǎng)基、人血清、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Fisher公司;Multiscreen 96孔板購(gòu)自美國(guó)Millipore公司; IL-2、IFN-γ單克隆抗體和生物素標(biāo)記的Anti-IFN-γ單克隆抗體購(gòu)自瑞典Mabtech公司;avidin-bound biotinylated horseradish peroxidase購(gòu)自Vector Laboratories公司;EL ISPOT分析儀為Cell Technology公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC細(xì)胞的分離 HPV自發(fā)清除后74個(gè)月收集靜脈血40 mL,Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),計(jì)數(shù)凍存。

1.2.2 抗原肽刺激PBMC,體外培養(yǎng) 前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)此病毒自發(fā)清除者體內(nèi)存在HPV16 E6 133-142表位特異性T細(xì)胞[1]。凍存的PBMC常規(guī)復(fù)蘇,檢測(cè)細(xì)胞活性,用含10%人血清的RPM I 1640培養(yǎng)基(RP-10H)過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞(濃度為2×106/mL)。收集后計(jì)數(shù)細(xì)胞,將細(xì)胞以1×106/mL/孔置于24孔板中,應(yīng)用抗原肽(HPV16 E6 133-142;10μmol/L)刺激PBMC細(xì)胞,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天,每孔加 IL-2(1 800 U/mL)。第7天,每孔加含 IL-2的RP-10H 1 mL。第10天,收集細(xì)胞,用RP-10H洗滌細(xì)胞,去除抗原肽和 IL-2,RP-10H繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。第11天,細(xì)胞計(jì)數(shù)后進(jìn)行EL ISPOT實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 EL ISPOT檢測(cè)表位特異性記憶T細(xì)胞應(yīng)用EL ISPOT方法,以EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞系[2](lymphoblastoid cell line,LCL)作為抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC),以HPV16 E6 133-142為抗原,檢測(cè)未經(jīng)抗原刺激的PBMC和經(jīng)抗原刺激11 d的PBMC中分泌產(chǎn)生IFN-γ的抗原特異性T細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。EL ISPOT步驟參考文獻(xiàn)[1]。用IFN-γ單克隆抗體(5μg/mL)包被Multiscreen 96孔板,4℃冰箱中過(guò)夜。次日棄包被液,PBS洗3次。用含5%人血清的RPM I 1640培養(yǎng)基(RP-5H;50μL/孔)37℃封閉2 h。每孔加入50μL LCL細(xì)胞(5×105/孔)、50μL PBMC(5×104/孔),50μL HPV E6 133-142(10μmol/L),實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性(PHA)和陰性對(duì)照(RP-5H)。每一條件設(shè)3個(gè)平行孔。平板置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。PBS洗3次后,加入生物素標(biāo)記的Anti-IFN-γ單克隆抗體(1μg/mL),37℃孵育2 h。PBS洗3次后,加入avidinbound biotinylated horseradish peroxidase,37℃孵育1 h。PBS洗3次后,diaminobenzene顯色。去離子水終止顯色。EL ISPOT分析儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)量。計(jì)算每一條件斑點(diǎn)數(shù)量的平均值作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

常規(guī)復(fù)蘇PBMC,過(guò)夜培養(yǎng)后,計(jì)數(shù)細(xì)胞,活細(xì)胞數(shù)為4.1×105,抗原肽刺激10 d后,細(xì)胞數(shù)增加為4.2×106,為抗原刺激前細(xì)胞數(shù)的10.2倍。第11天,細(xì)胞數(shù)為4.65×106,為抗原刺激前細(xì)胞數(shù)的11.3倍。

2.2 EL ISPOT檢測(cè)PBMC中的記憶T細(xì)胞

圖1 EL ISPOT檢測(cè)經(jīng)抗原刺激的PB MC中HPV特異性的T細(xì)胞Fig.1 HPV-specific T cells in antigen-stimulated PBMC by EL ISPOT

EL ISPOT結(jié)果顯示,PBMC中的記憶T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后活化為效應(yīng)細(xì)胞,能夠識(shí)別APC遞呈的抗原肽HPV16 E6 133-142,并分泌IFN-γ(圖1)。而未經(jīng)抗原刺激的PBMC不能識(shí)別APC遞呈的抗原肽(圖2)。通過(guò)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)量,推算PBMC中抗原特異性的記憶T細(xì)胞的頻數(shù)。公式如下:記憶T細(xì)胞的頻數(shù)=(計(jì)數(shù)抗原肽刺激孔斑點(diǎn)數(shù)量-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)量)÷PBMC數(shù)量÷細(xì)胞增加倍數(shù)。此HPV自發(fā)清除者外周血中抗原特異性的記憶T細(xì)胞的頻數(shù)為(69-30)÷(5×104)÷11.3=0.007%。

圖2 EL ISPOT檢測(cè)未經(jīng)抗原刺激的PBMC中HPV特異性的T細(xì)胞Fig.2 HPV-specific T cells in antigen-unstimulated PBMC by EL ISPOT

3 討 論

機(jī)體內(nèi)的初始T細(xì)胞識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞遞呈的抗原后,可被激活,分化為效應(yīng)T細(xì)胞[3]。當(dāng)機(jī)體清除抗原,效應(yīng)細(xì)胞中的一部分可分化轉(zhuǎn)為記憶T細(xì)胞。當(dāng)再次接觸相同抗原時(shí),抗原特異性的記憶T細(xì)胞可迅速增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞[4-5]。相較于初始T細(xì)胞,記憶T細(xì)胞具有較低的活化閾值和較強(qiáng)的效應(yīng)功能。因此在防止病原菌的再感染過(guò)程中,記憶T細(xì)胞反應(yīng)迅速,功能強(qiáng)大,發(fā)揮重要作用[6]。

體外抗原刺激可活化PBMC中的記憶T細(xì)胞[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用已經(jīng)鑒定的表位肽HPV16 E6133-142[1]刺激HPV自發(fā)清除者(HPV清除后74個(gè)月)的PBMC,使其中的記憶T細(xì)胞增殖分化為效應(yīng)細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)抗原刺激11 d后,細(xì)胞數(shù)量增加11.3倍,表明PBMC中含有HPV16 E6133-142特異性的記憶T細(xì)胞,此T細(xì)胞經(jīng)特異性抗原肽激活后,分化為效應(yīng)細(xì)胞,細(xì)胞分裂增殖,數(shù)量增加。

EL ISPOT可以從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)出單個(gè)分泌細(xì)胞,具有較高的可靠性、重復(fù)性及敏感性。本研究應(yīng)用EL ISPOT方法檢測(cè)活化的記憶T細(xì)胞中分泌IFN-γ的T細(xì)胞的數(shù)量,來(lái)推算PBMC中抗原特異性的記憶T細(xì)胞的數(shù)量。經(jīng)計(jì)算,此HPV自發(fā)清除者(病毒清除后74個(gè)月)外周血中抗原特異性的記憶T細(xì)胞的頻率約為0.007%。本研究結(jié)果為進(jìn)一步疫苗設(shè)計(jì)提供重要的理論依據(jù)。

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