10種常見細菌基因檢測膜條的研制

朱飛舟,陳利玉,劉新發,田 奇,談 成,歐陽方丹,吳正理＊,陳漢春＊

(1.中南大學生物科學與技術學院生物化學系,湖南長沙 410013;2.中南大學基礎醫學院醫學微生物學系,湖南長沙 410013;3.中南大學生物科學與技術學院生物實驗中心,湖南長沙 410013)

病原菌引起的感染性、傳染性疾病是威脅人類健康和導致社會恐慌的重要因素,快速準確地檢測病原菌是有效預防和治療這類疾病的關鍵。常規的生理生化、血清學鑒定方法操作繁瑣、周期長,而且某些病原菌培養困難。PCR、EL ISA等方法雖然縮短了檢測周期,但假陽性率高[1-2]。基因芯片(gene chip)技術的興起,使快速、微量、準確、高通量地檢測病原菌成為可能[3]。基因芯片檢測病原菌選取的靶基因一般為16S rRNA和23S rRNA基因及16S～23S rRNA基因間隔區等[4],標記基因的方法有Cy3或Cy5等熒光染料、生物素、地高辛等[4-5]。目前應用的病原菌檢測芯片多采用熒光標記,操作中需要激光共聚焦微陣列掃描儀、基因芯片點樣儀等貴重儀器[6]。本研究選取細菌16S rRNA基因為檢測靶點并設計探針,硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質,利用生物素標記16S rRNA基因PCR擴增片段,然后雜交和檢測,建立了一種高通量、低成本、快速、準確的細菌檢測方法。該方法具有良好的臨床應用前景,對感染性、傳染性疾病的預防、診斷、治療具有重要的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

10種細菌:大腸埃希菌,腸道沙門菌,粘質沙雷菌,陰溝腸桿菌,奇異變形桿菌,銅綠假單胞菌,鮑曼不動桿菌,枯草芽胞桿菌,溶血性葡萄球菌,金黃色葡萄球菌由中南大學基礎醫學院醫學微生物學系保存。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA提取 ①CTAB法提取細菌基因組DNA:接種菌株于LB液體培養基,37℃震蕩培養過夜,取1.5 mL培養物于12 000 r/min離心2 min。去上清液,加入567μL的TE緩沖液,震蕩重新懸浮細菌。然后,加入30μL 10%SDS和15μL 20 mg/mL蛋白酶K(革蘭陽性菌需先加入20μL 10 mg/mL溶菌酶,37℃反應15 min后再加入蛋白酶K),混勻,于37℃溫育1 h,其間多次顛倒混勻。溶液變澄清則表示細菌裂解完全。隨后,加入100μL 5 mol/L NaCl和80μL CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化銨)/NaCl溶液(5 g CTAB溶于100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液中,加熱至65℃使之溶解后室溫保存),混勻,65℃溫育10 min,可見白色沉淀。然后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25◇24◇1),混勻至乳濁狀。12 000 r/min離心5 min,轉上清液至一潔凈試管,加入與上清液等體積的異丙醇,輕輕混勻,直至產生絮狀DNA沉淀。12 000 r/min離心5 min,去上清液,沉淀用1 mL的70%乙醇洗滌。離心,棄乙醇,在潔凈工作臺中干燥沉淀。最后,將沉淀溶于50μL TE緩沖液,加入1μL RNase A(10 mg/mL),4℃保存備用;②丙酮直接煮沸法:取細菌懸液,加入等體積丙酮,置于沸水浴中煮沸10 min。然后12 000 r/min離心2 min,其上清液即為細菌DNA溶液,可以作為PCR擴增的模板。

1.2.2 PCR擴增16S rRNA基因片段 引物合成和生物素標記由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。建立50μL PCR反應體系:DNA模板1μL,ddH2O 38.5μL,10×PCR緩沖液5μL,25 mmol/L MgCl22μL,10 mmol/L dNTP 1μL,20 μmol/L引物(1)1μL,20μmol/L引物(2)1μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL。采用PTC-100 Peltier Ther malCycler(B IO-RAD)進行PCR反應,反應程序為94℃變性5 min后于94℃變性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸90 s,30個循環后于72℃延伸7 min。4℃保存備用。

1.2.3 PCR產物序列分析 引物27F和1492R對細菌16S rRNA基因的PCR產物正反測序,由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2.4 序列同源性比對 根據測序所得的10種細菌16S rRNA基因片段的序列圖,去掉兩端的不規則峰,取中間1 380 bp片段序列進行同源性分析。如果要鑒定細菌,則將序列導入美國NCB I網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的blastn在線軟件,選擇Nucleotide collection(nr/nt)數據庫,然后運行blastn程序,取16S rRNA基因序列同源性最高的細菌作為鑒定的結果。如果要比對10種病原細菌16S rRNA基因序列的同源性,則將它們的序列導入ClustalX(1.86)軟件,然后在菜單中選擇Alignment→Do Complete Alignment,即得10種細菌的16S rRNA基因序列同源性比對圖。

1.2.5 基因檢測膜條的制備 根據10種病原細菌16S rRNA基因序列比對的結果,在引物對250F/Bio-1020R擴增的770 bp片段內,尋找序列多態性位點,并以該位點的正向序列設計探針,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。將探針按圖5的布局點在硝酸纖維素膜上,80℃烤膜1～2 h,使探針與膜牢固結合,即得10種病原細菌的基因檢測膜條。

1.2.6 核酸分子雜交 以細菌DNA為模板,用引物對250F/Bio-1020R進行PCR擴增,得到生物素標記的16S rRNA基因770 bp片段。將該PCR產物100℃水浴變性5 min,冰浴驟冷。基因檢測膜條經預雜交后,向雜交液中加入變

性的生物素標記的PCR產物,雜交1 h,洗膜。然后,封閉30 min,SA-AP(streptavidin labled by alkaline phosphatase,堿性磷酸酶標記的鏈親和素)(1◇1 000稀釋)結合30 min,洗膜,NBT(nitroblue tetrazolium,硝基四氮唑藍)/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate,5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)顯色。肉眼觀察,Gel DocTMXR+ Imaging System(B IO-RAD)照相。

2 結果與分析

2.1 16S rRNA基因序列分析法鑒定細菌

為確定這10種細菌,在制備基因檢測膜條之前采用16S rRNA基因序列分析法對這10種細菌進行鑒定。采用CTAB法或丙酮直接煮沸法提取細菌基因組DNA。結果表明,CTAB法和丙酮直接煮沸法提取的DNA均可作為PCR擴增的模板,但丙酮直接煮沸法快速、簡單,更適于臨床應用。27F和1492R引物的通用性好,可以擴增10種細菌的16S rRNA基因片段,擴增片段大小為1 450 bp左右(圖1)。以擴增片段為模板,引物27F和1492R正反測序,然后根據序列的同源性對細菌進行鑒定,同源性最高的細菌即為鑒定的結果。以金黃色葡萄球菌鑒定為例進行說明。取測序所得的金黃色葡萄球菌16S rRNA基因1 380 bp片段的序列,在線軟件blastn中比對后,選擇Taxonomy reports,即可得到具有同源序列的細菌,以同源性從高到低的順序從上往下排列,序列同源性最高的細菌就是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(圖2)。10種細菌鑒定的結果見表1。

2.2 設計10種細菌的通用引物和探針

為設計通用引物和探針,將10種細菌16S rRNA基因片段序列進行比對,尋找16S rRNA基因中的序列保守區和多態區(圖3)。利用保守區設計通用引物250F和bio-1020R(表2),利用多態區設計探針。

2.3 膜條檢測10種細菌

將10種細菌的16S rRNA基因片段進行體外擴增,并在擴增的同時將擴增片段進行生物素標記。以細菌的基因組DNA為模板,通用引物250F、bio-1020R可以擴增10種細菌的16S rRNA基因片段,長度在770 bp左右(圖4A)。隨后,檢測反向引物bio-1020R生物素標記是否成功,結果發現1020R(沒有生物素標記、但序列與bio-1020R完全相同的引物)經檢測沒有信號,而bio-1020R經檢測有很強的信號,說明生物素已經成功標記在bio-1020R引物的5′端(圖4B)。這也說明擴增得到的16S rRNA基因片段已經被生物素標記,可以用于后續的核酸分子雜交實驗。

圖2 金黃色葡萄球菌16S rRNA基因片段序列在Nucleotide數據庫中比對的結果Fig.2 Aligning 16S rRNA gene fragment sequence ofStaphylococcusaureus in Nucleotide database

圖3 10種細菌16S rRNA基因序列比對Fig.3 Alignment of 16S rRNA gene fragment sequences of 10 species of bacteria

圖4 用于核酸分子雜交的16S rRNA基因片段擴增Fig.4 Amplifying 16S rRNA gene fragments used in DNA hybridization

表1 16S rRNA基因序列分析法鑒定細菌的結果Table 1 Identification of bacteria by 16S rRNA gene sequence analysis

表2 16S rRNA基因片段擴增引物Table 2 Primer sequences for amplifying 16S rRNA gene fragments

用擴增的10種細菌的16S rRNA基因片段分別與膜條進行雜交,檢測膜條的特異性和有效性。用膜條分別與10種細菌16S rRNA基因擴增片段雜交,結果發現出現相對應的、特異性的信號,而無序的核酸探針均沒有信號,細菌通用探針均出現信號(圖6A～J)。這說明該膜條能特異地、有效地檢測這10種細菌。同時擴增大腸埃希菌、腸道沙門菌、粘質沙雷菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌5種細菌的16S rRNA基因片段,并與膜條雜交,結果發現5種菌的探針均出現信號,說明該膜條可以同時檢測出這5種細菌(圖6K)。

圖5 10種細菌檢測膜條的探針排列順序Fig.5 Array of probes for 10 species of bacteria in the membranous oligonucleotide chip

圖6 膜條檢測10種細菌Fig.6 Detection of 10 species of bacteria by the membranous oligonucleotide chip

3 討 論

目前,病原菌的常規檢測主要采用細菌培養、生化鑒定和血清學抗原抗體檢測等傳統方法。這些方法操作繁瑣、周期長、通常報告結果需要3～5 d,而且某些病原菌培養困難。近年來也發展了PCR、EL ISA等技術,但無法滿足一次檢測多樣本和多種病原體的需求,且假陽性率較高[1-2]。基因芯片是指將許多特定的DNA片段作為探針有序地緊密排列并固定在固相支持物上,然后與待測的標記樣品進行雜交,雜交后進行檢測和比較分析。該技術自20世紀末出現以來,已經被廣泛地應用于生命科學的眾多領域,如基因表達分析、基因突變檢測、基因診斷、新基因發現等。在病原菌檢測方面,基因芯片以快速、微量、準確、高通量的特點,迅速得到廣泛應用[7-9]。

與傳統病原菌檢測方法相比,本研究建立的膜條雜交法的優勢在于:1、高度靈敏性。可以直接檢測臨床樣本中的病原菌,無需培養。第一步是PCR,可以直接以臨床樣本中病原菌的微量DNA為模板,擴增16S rRNA基因片段;2、高準確性。膜條能特異有效地檢測10種細菌中的任何一種,準確性高,不存在交叉反應。3、高通量。1張膜條可以同時檢測多種病原菌,且DNA提取、PCR、雜交、檢測均可多個樣本同時進行。4、快速。全部流程在1個工作日內即可完成。

在基因芯片技術中,標記基因的方法有Cy3或Cy5等熒光染料、生物素、地高辛等[4-5,10],基質有玻片、硝酸纖維素薄膜、尼龍膜等[11-12]。最近,在病原菌的基因芯片檢測技術中涌現出一些新方法,如96微孔板DNA診斷芯片[13]、Lab-on-achip[14]。96微孔板DNA診斷芯片,即將多個病原菌的檢測探針點在96孔板的1個孔中。Labon-a-chip就是將樣品制備、PCR、雜交等操作流程集中在1塊板上,1次即可完成所有的程序。

本研究選用硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質,采用生物素標記細菌16S rRNA基因的擴增片段,SA-AP檢測生物素標記,然后NBT/BCIP顯色,建立了一種快速、準確、低成本的細菌檢測方法。與其他基因芯片方法相比,本方法具有成本低、無需特殊設備、結果直觀等優點。

本研究選用10種常見細菌為研究材料,目的是建立用膜條檢測樣本中病原菌的方法。在此基礎上可開發感染性疾病和/或病原菌及支原體、病毒等鑒別診斷膜條。本方法將為促進生物產業的發展作出積極的貢獻。

[1] 于廣福,朱小明,鄧文,等.泌尿系統細菌感染多重PCR檢測方法建立[J].中國公共衛生,2010,26(8):1071-1072.

[2] 吳玉紅.EL ISA法檢測HBsAg出現假陽性的原因探討[J].中國現代醫生,2010,48(19):81-82.

[3] 張艷紅.基因芯片技術在臨床微生物學中的應用[J].河北醫藥,2005,27(5):376-378.

[4] 金大智,文思遠,王升啟.基因芯片技術在檢測腸道致病菌方面的應用[J].微生物學報,2006,46(3):500-503.

[5] 洪幫興,江麗芳,胡玉山,等.運用23S r DNA芯片技術進行食源性感染常見致病菌的快速鑒定[J].中國衛生檢驗雜志,2004,14(2):144-147.

[6] Jin D Z,Wen S Y,Chen S H,et al.Detection and identification of intestinalpathogens in clinical specimens usingDNA microarrays[J].Molecular and Cellular Probes,2006,20(6):337-347.

[7] Kim CM,Song E S,Jang H J,et al.Development and evaluation of oligonucleotide chip based on the 16S-23S rRNA gene spacer region for detection of pathogenic microorganisms associated with sepsis[J].Journal of ClinicalMicrobiology,2010,48(5):1578-1583.

[8] Mao H,Lu Z,Zhang H,et al.Colorimetric oligonucleotide array for genotyping of hepatitis C virus based on the 5’non-coding region[J].Clinica Chimica Acta,2008,388(1-2):22-27.

[9] Mao H,Zhang H,Zhao J,et al.Clinical evaluation of a colorimetric oligonucleotide chip for genotyping hepatitisC virus[J].ClinicalBiochemistry,2010,43(1-2):214-219.

[10] Xuan S H,Zhou Y G,Shao B,et al.Enzymic colorimetrybased DNA chip:a rapid and accurate assay for detectingmutations for clarithromycin resistance in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori[J].Journal ofMedicalMicrobiology,2009,58(11):1443-1448.

[11] 陳廣全,張惠媛,汪琦,等.用寡核苷酸微陣列芯片方法檢測常見的食源性致病微生物[J].食品與發酵工業,2007,33(12):122-126.

[12] 張英朗,王麗婭,李智濤,等.常見角膜致病真菌基因芯片檢測方法的實驗[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(10):1873-1877.

[13] 莫秋華,李強,林繼燦,等.食源致病菌96微孔板DNA診斷芯片的研制及在一起食物中毒突發事件中的應用[J].南方醫科大學學報,2010,30(3):417-421.

[14] Schulze H,Giraud G,Crain J,et al.Multiplexed optical pathogen detection with lab-on-a-chip devices[J].Journal of Biophotonics,2009,2(4):199-211.