抗水稻白葉枯的菌株—白蟻鏈霉菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

宋迤明,董夏夢(mèng),蔡琪敏,藍(lán)麗精,蔣冬花

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004)

許多微生物因?yàn)榭梢援a(chǎn)生具有高度活性的蛋白酶和糖苷酶而被篩選應(yīng)用于研究和生產(chǎn)[1-2]。放線菌類尤其是鏈霉菌普遍應(yīng)用于抗生素生產(chǎn),菌體廣泛存在于土壤中[3]。研究結(jié)果顯示,鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)為次級(jí)代謝產(chǎn)物,可以在自然環(huán)境中發(fā)生降解[4]。鏈霉菌菌株可以產(chǎn)生約6 550種抗生素類物質(zhì),約占由放線菌產(chǎn)生抗生素總量的70%[5-6]。其產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì),可以特異性地作用于某些病原菌,降低其生長(zhǎng)和繁殖速度,進(jìn)而可以降低病害發(fā)作的頻率[3]。這些抗生素類物質(zhì)可以作為生物農(nóng)藥使用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,在病害的生物防治中發(fā)揮著重要作用[7]。水稻白葉枯病又稱為白葉瘟、茅草瘟、地火燒等,是由水稻黃單胞桿菌(Xanthom onas oryzae)引起的,為水稻的主要病害[8]。該病害可對(duì)水稻生產(chǎn)造成重大影響,甚至顆粒無(wú)收。現(xiàn)階段的主要防治途徑是進(jìn)行化學(xué)防治,而過(guò)量施加殺枯凈、噻枯唑等藥劑會(huì)導(dǎo)致病原菌抗性增強(qiáng)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞[9]。因此,從自然環(huán)境中篩選對(duì)白葉枯病菌具有拮抗作用的微生物菌株,是白葉枯病防治的一個(gè)重要方向[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 放線菌ACT-2菌株:本實(shí)驗(yàn)室自行篩選獲得,保存于本實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC,保存編號(hào):CCTCCCM 2011008);供試病原菌:白葉枯病菌(Xanthom onas oryzaepv.oryzae)P6生理小種,具有很強(qiáng)的毒性,由浙江師范大學(xué)生化學(xué)院遺傳實(shí)驗(yàn)室提供;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽芽胞桿菌(B acillus anthracis)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)和半裸鐮刀菌(Fusarium sem itectum)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①高氏一號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g,KNO31 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.5 g,NaCl 0.5 g,FeSO40.01 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2～7.5;②PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH 6.5;③牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 抗白葉枯病菌放線菌菌株篩選 取樣品(水稻試驗(yàn)田土樣、腐殖質(zhì)等)1 g,加入10 mL無(wú)菌水中搖床120 r/min震蕩30 min,靜置20 min。取100μL上清液加入到高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上,均勻涂布。28℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于平板上劃線,3次傳代純化,保藏于試管斜面,并置于4℃冰箱。取保藏于-80℃冰箱白葉枯病菌P6生理小種接種于PDA液體,培養(yǎng)基搖床活化培養(yǎng)(120 r/min),當(dāng)菌密度達(dá)到OD600為0.6時(shí),取100μL菌液均勻涂布到PDA固體培養(yǎng)基上。用打孔器取直徑為0.5 cm的放線菌菌餅移接到涂布有P6小種的PDA固體培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)36～48 h,篩選具有拮抗能力的放線菌菌株。以牛津杯法[11]復(fù)篩獲得對(duì)白葉枯病菌拮抗能力較強(qiáng)的放線菌菌株。

1.2.2 拮抗放線菌ACT-2菌株的鑒定 ①形態(tài)觀察:將放線菌ACT-2菌株接種到高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)36 h,觀察菌落形態(tài)特征。以插片培養(yǎng)法觀察ACT-2菌株的菌絲和生長(zhǎng)特征。將ACT-2菌株劃線接種到高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上,將滅菌的蓋玻片以大約45°插入到培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)36 h后,每12 h鏡檢記錄氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的特征,并記錄孢子產(chǎn)生時(shí)間等;②16S r DNA序列分析:DNA提取采用生工SK1201-UN IQ-10 DNA提取試劑盒。以通用引物1492R和27F,序列為:1492R:5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′和27F:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。16S rDNA片段的擴(kuò)增條件:98℃預(yù)變性5 min,95℃變性35 s,55℃復(fù)性35 s,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增,72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠50 V電泳1.5 h,檢測(cè)產(chǎn)物。將產(chǎn)物測(cè)序,與NCB I中已經(jīng)登錄的基因序列比對(duì),確定菌株所在屬種。以DNAStar分析序列,根據(jù)比對(duì)結(jié)果,利用MEGA 4.0以neighbour-joining法建立進(jìn)化樹[12];③生理生化試驗(yàn):對(duì)ACT-2菌株碳氮源使用能力進(jìn)行測(cè)定;測(cè)定該菌株對(duì)酪蛋白、明膠、淀粉、尿素等大分子物質(zhì)的降解能力;測(cè)試ACT-2菌株在不同鹽濃度、不同pH和高溫下的存活能力,試驗(yàn)方法參見(jiàn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[13]。

1.2.3 放線菌ACT-2菌株抗菌譜測(cè)定 選取白葉枯病菌P6小種、金黃色葡萄球菌、炭疽芽胞桿菌、大腸埃希菌、尖孢鐮刀菌和半裸鐮刀菌作為測(cè)試菌,測(cè)定ACT-2菌株的抗菌譜。將測(cè)試菌分別用PDA和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化,取100 μL菌液均勻涂布到對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上;用打孔器取直徑為0.5 cm的放線菌菌餅移接到涂布有測(cè)試菌液的固體培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)24～36 h,觀察ACT-2菌株對(duì)不同病原菌的拮抗結(jié)果。

1.2.4 發(fā)酵液的制備和抑菌能力的測(cè)定 從固體培養(yǎng)基ACT-2菌落上刮取少量的孢子,置于裝有高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的搖瓶中(裝液量50 mL/250 mL、pH 7.2～7.5),180 r/min 28℃搖床培養(yǎng)36 h。作為種子搖瓶。取100μL加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,48 h恒溫?fù)u床培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液置于50 mL離心管中10 000 r/min離心10min,上清液通過(guò)2層0.22μm細(xì)菌過(guò)濾膜過(guò)濾,除去殘余孢子。28℃恒溫培養(yǎng)48 h,以牛津杯法測(cè)量抑菌能力。設(shè)置測(cè)定3組平行對(duì)照,取平均值。

1.2.5 放線菌ACT-2菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 依照單因子變量?jī)?yōu)化法[14],選取溫度、pH、裝液量和搖床轉(zhuǎn)速等因素,分別設(shè)定其范圍和梯度,進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。溫度:溫度范圍24～34℃,梯度為2℃;pH:將高氏一號(hào)培養(yǎng)液初始pH值調(diào)到6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5 6個(gè)梯度;搖床轉(zhuǎn)速:選取搖床轉(zhuǎn)速120～240 r/min范圍,梯度為30 r/min;裝液量:選用250 mL規(guī)格的搖瓶,分別裝入10、30、50、70、90 mL培養(yǎng)液。按照以上設(shè)定的條件,將菌種接到高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)48 h,以牛津杯法測(cè)定發(fā)酵液抑菌能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

經(jīng)分離、純化,共獲得167株放線菌,初篩選出對(duì)白葉枯病菌具有拮抗作用的16株放線菌,經(jīng)復(fù)篩確定具有最強(qiáng)拮抗能力的放線菌ACT-2菌株(圖1)。

圖1 拮抗白葉枯病菌代表性菌株(左)和ACT-2菌株抑菌圈(右)Fig.1 The typical antagonistic strains(left)and inhibition zone of the strain ACT-2 toXanthomonas oryzaepv.oryzae(right)

2.2 放線菌ACT-2菌株的鑒定結(jié)果

形態(tài)觀察:菌落表面粗糙、干燥;初期顏色潔白,72 h后有少許粉色,96 h后菌落帶有明顯的粉色。顯微鏡下觀察:ACT-2菌株氣生菌絲直、柔曲,分枝較多,無(wú)橫隔,不斷裂,72 h時(shí)出現(xiàn)少量斷裂現(xiàn)象;基內(nèi)菌絲較短、交織呈網(wǎng)狀;氣生菌絲較基內(nèi)菌絲色澤深,更加粗壯(圖2)。孢子絲多呈直線,存在分叉,少部分呈彎曲狀;平板劃線培養(yǎng)36 h時(shí),孢子絲少量存在于顯微鏡視野中;48 h時(shí),孢子絲大量出現(xiàn);72 h時(shí),孢子絲開始脫落。孢子呈橢圓形、長(zhǎng)圓形,表面光潔。16S r DNA序列:以1492R和27F為引物,對(duì)ACT-2菌株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè),獲得一段1.389 kb的16S rDNA片段。經(jīng)過(guò)測(cè)序,ACT-2菌株與鏈霉菌屬白蟻鏈霉菌(Streptom yces ter m itum)同源性最高,達(dá)到98.6%(圖3)。ACT-2菌株的Gen-Bank登錄號(hào)為HQ680451。

圖2 ACT-2菌的基內(nèi)菌絲(左)、氣生菌絲和孢子絲(右)的特征(400×)Fig.2 The mycelium characteristics of strain ACT-2,including aerialmyceliums(left),aerialmyceliums and sporotrichial(right)(400×)

圖3 ACT-2菌株和鏈霉菌屬相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree inferred for strain ACT-2 and relatedStreptomycesstrains

2.3 ACT-2菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

表1 ACT-2菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test reults of strain ACT-2

表1結(jié)果顯示,ACT-2菌株可以利用除肌醇和鼠李糖以外的其他碳源,對(duì)氮源并沒(méi)有表現(xiàn)出選擇性,可以在不同的氮源環(huán)境下生長(zhǎng);ACT-2菌株對(duì)酪蛋白等大分子物質(zhì)表現(xiàn)出明顯的降解能力,而V-P實(shí)驗(yàn)的陰性反應(yīng)則說(shuō)明該菌株并不能產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物;該菌株對(duì)酸性和弱堿環(huán)境以及高溫環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力,同時(shí),ACT-2菌株在鹽濃度為2%的環(huán)境中可以生存,對(duì)高于2%鹽濃度的培養(yǎng)條件則不具備耐受性,不能生存。

2.4 ACT-2菌株的抗菌譜

由表2可知,ACT-2菌株對(duì)白葉枯病菌P6小種、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和炭疽芽胞桿菌等細(xì)菌類病原菌,具有較強(qiáng)拮抗能力,可以在菌體周圍形成明顯的抑菌圈(圖4);而對(duì)尖孢鐮刀菌和半裸鐮刀菌等真菌類病原菌,則沒(méi)有明顯的拮抗作用。

表2 ACT-2菌株對(duì)不同病原菌的拮抗能力Table 2 The inhibiting ability of strain ACT-2 to different pathogenicbacterias

圖4 ACT-2菌株對(duì)大腸埃希菌(左)、金黃色葡糖球菌(中)和炭疽芽胞桿菌(右)的抑菌圈Fig.4 Inhibition effects of strain ACT-2 onEscherichia coli(left),Staphylococcus aureus(mid)andBacillus anthracis(right)

圖5 發(fā)酵條件對(duì)ACT-2菌株發(fā)酵液拮抗白葉枯病菌的影響Fig.5 Effects of culture conditions on fer mentation of strain ACT-2

2.5 ACT-2菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

經(jīng)過(guò)培養(yǎng)條件單因子變量法優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知:①溫度:在24～28℃范圍內(nèi),ACT-2菌株發(fā)酵液抑菌能力隨溫度升高而增強(qiáng);當(dāng)溫度為28℃時(shí),發(fā)酵液抑菌效果達(dá)到最大,抑菌圈直徑為24.33 mm;溫度繼續(xù)升高時(shí),發(fā)酵液抑菌作用隨之下降;所以,選擇28℃為ACT-2菌株的最適發(fā)酵溫度;②初始pH:當(dāng)初始pH在6.0～7.5時(shí),隨著初始pH的升高,發(fā)酵液抑菌作用隨之升高;當(dāng)初始pH為7.5時(shí),ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌圈直徑達(dá)到最大,為24.33 mm;培養(yǎng)基的初始pH在7.5～8.5時(shí),隨著初始pH值升高,抑菌作用逐漸下降,抑菌圈直徑隨之減小;因此,培養(yǎng)基初始pH調(diào)至7.5為最佳;③搖床轉(zhuǎn)速:主要影響到發(fā)酵液的溶氧,轉(zhuǎn)速在120～180 r/min之間時(shí),發(fā)酵液的抑菌效果與轉(zhuǎn)速呈正比關(guān)系;當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r/min時(shí),抑菌圈直徑達(dá)到24.55 mm;搖床轉(zhuǎn)速繼續(xù)上升,抑菌圈直徑變化并不明顯;因此,選擇搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min作為ACT-2菌株發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速;④由圖5裝液量圖表部分顯示,裝液量為每250 mL裝入50 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基時(shí),發(fā)酵液抑菌作用最好,抑菌圈直徑為26.20 mm。裝液量過(guò)少或者過(guò)多,對(duì)抑菌作用均不利;如裝液量超過(guò)50 mL,抑菌作用明顯減弱,因此培養(yǎng)基最佳裝液量選擇為50 mL/250 mL。

3 討 論

鏈霉菌廣泛存在于自然界的土壤中[3],并被廣泛應(yīng)用于抗生素的生產(chǎn)中[5-6]。本文以白葉枯病菌小種P6作為篩選指示菌,得到了1株對(duì)白葉枯病菌具有較強(qiáng)拮抗能力的ACT-2菌株,通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)和顯微特征的觀察、16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行進(jìn)化分類學(xué)的劃分,鑒定該菌株為白蟻鏈霉菌(Streptom yces ter m itum)。白蟻鏈霉菌由Duch等人于1951年首次分離自白蟻體內(nèi),到目前為止,關(guān)于白蟻鏈霉菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

生理生化實(shí)驗(yàn)顯示,白蟻鏈霉菌ACT-2菌株對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力;抗菌譜測(cè)定結(jié)果表明:ACT-2菌株對(duì)細(xì)菌類病原菌表現(xiàn)出明顯的拮抗能力,對(duì)真菌類病原菌拮抗性并不明顯。對(duì)白蟻鏈霉菌ACT-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性研究發(fā)現(xiàn):在發(fā)酵條件適宜的情況下,ACT-2菌株的發(fā)酵液對(duì)水稻白葉枯病菌具有較強(qiáng)拮抗作用,抑菌圈直徑可達(dá)26.20 mm。白蟻鏈霉菌ACT-2菌株及其發(fā)酵液對(duì)白葉枯病菌的拮抗作用說(shuō)明該菌可以合成某種抗菌物質(zhì)并釋放到周圍環(huán)境[15],其對(duì)白葉枯病菌的生長(zhǎng)和繁殖具有較強(qiáng)的抑制作用。白蟻鏈霉菌有希望作為生防菌用于水稻白葉枯病菌的防治。但是,這些具有生物活性的抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能現(xiàn)在尚不清楚,其分子結(jié)構(gòu)和拮抗機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究。

[1] Kumar CG,Takagi H.Microbial alkaline proteases:from a bioindustrial viewpoint[J].BiotechnolAdv,1999,17(7):561-594.

[2] Miura T,Okamoto K,Yanase H.Purification and characterization of extracellular 1,2-α-L-fucosidase fromBacillus cereus[J].J BiosciBioeng,2005,99(6):629-635.

[3] Merav K,Marianna O,Ilan Ch,et al.Soil-borne strain I C14 ofSerratia plymuthicawith multiple mechanis ms of antifungal activity provides biocontrol ofBotrytis cinereaandSclerotinia sclerotiorumdiseases[J].SoilBiolBiochem,2003,35(2):323-331.

[4] Zhao Z,WangQ,Wang K,et al.Study of the antifungal activity ofBacillus vallisortisZZ185 in vitro and identification of its antifungal components[J].Bioresoure Technol,2010,101(1):292-297.

[5] Bérdy J.Bioactive microbialmetabolites[J].J Antibiot,2005,58(4):1-26.

[6] Piyapat S,Somboon T,Khanit S.16S r DNA sequence and analysis antimicrobial activities ofStreptomycesstrains from Thai soils[J].Int J Environ Heal R,2008,22(1):1-8.

[7] Paulitz TC,BelangerRR.Biological control in greenhouse systems[J].Annu Rev Phytopathol,2001,39:103-133.

[8] Adhikari TB,Cruz CMW,Hang Q.Genetiediversity ofXanthomonas oryzaepv.oryzaein Asia[J].Appl Environ Micro,1995,61(3):966-971.

[9] 沈光斌,周明國(guó).水稻白葉枯病菌噻枯唑抗藥突變體生物學(xué)性質(zhì)研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,24(4):33-36.

[10] Zhang YL,Ge HM,Li F,Song YC,et al.New phytotoxicmetabolites fromPestalotiopsissp.HC02,a fungus residing in Chondracris roseegut[J].Chem Biodivers,2008,5(11):2402-2407.

[11] 劉冬梅,李理,楊曉泉.用牛津杯法測(cè)定益生菌的抑菌活力[J].食品研究與開發(fā),2006,27(3):110-111.

[12] SaitouN,NeiM.The neighbour-joiningmethod:a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].MolBiol Evol,1987,4(4):406-425.

[13] 周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1983.

[14] 焦秀穎,劉志民,馬煥普,等.一株抗根癌菌的拮抗放線菌菌株的初步鑒定及培養(yǎng)條件研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,25(1):41-44.

[15] ManzoniM,RolliniM.Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and applications of these cholesterol-lowering drugs[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,58(5):555-564.