沙眼衣原體血清型L2體外培養影響因素的研究

張軍華,陳麗麗,李忠玉,吳移謀＊

(1.南華大學病原生物學研究所,湖南衡陽 421001;2.中南大學湘雅三醫院輸血科,湖南長沙 410013)

沙眼衣原體(Chlam ydia trachom atis,Ct)是一種專性細胞內寄生,具有獨特發育周期的原核型微生物,是目前國內外最常見的性病病原體,與人類疾病相關的有2個生物型,即沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫生物型(lymphogranuloma venereum,LGV),LGV的血清型有L1、L2和L3,其中L2進一步被分為L2、L2a、L2b和L2′亞型[1]。LGV引起性病淋巴肉芽腫,又稱腹股溝淋巴肉芽腫(Lyphogranuloma inguinale)、第四性病,俗稱“魚口”或者“便毒”。自從2003年荷蘭男男性行為人群(men who have sex with men,MS M)中暴發流行LGV以后,相繼有許多文獻報道歐洲、北美和澳洲出現大量LGV病例,這些病例大多數由血清型LGV L2感染所致[1-4]。血清型LGV L2侵襲力較其他型強,需更長療程的治療才能清除病原體和阻止晚期嚴重后遺癥的發生[5]。文獻報道,LGV的潰瘍損害與艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,H IV)的感染和傳播密切相關[6-7],因此,LGV近年來越來越受到廣泛的重視。LGV的臨床表現缺乏特異性,確診依賴實驗室診斷。但目前尚沒有商品化的試劑可以診斷LGV,而病原體的分離培養認為是診斷感染性疾病的“金標準”方法。因此,優化Ct血清型LGV L2的培養條件和比較其在不同細胞中的發育,將對Ct血清型LGV L2相關實驗研究及其感染的臨床診斷有較重要意義。研究表明Ct血清型LGV L2主要在人和非人類的上皮細胞和成纖維細胞中生存和發育,且其生長情況受細胞類型和培養環境影響[8-12]。本實驗選取HeLa、HEp-2、Vero 3種上皮細胞和HepG-2和SGC-7901 2種類上皮樣生長細胞培養血清型LGV L2,采用間接免疫熒光法和Real-Time PCR法檢測血清型LGV L2在上述5種細胞內的生長情況,并通過設置放線菌酮組和二乙氨基葡聚糖(DEAE-dextran)處理組和不處理組,比較不同培養條件下血清型LGV L2在各細胞內的生長情況,確定LGV L2血清型在體外培養的最佳生長發育條件,為臨床標本中血清型LGV L2的分離培養和進一步研究血清型LGV L2的相關實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞株 沙眼衣原體血清型LGV L2由南華大學病原生物學研究所保存;HEp-2細胞(人喉癌上皮細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎上皮細胞)、HepG-2細胞(人肝癌細胞)、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)和SGC-7901(人胃癌細胞)均由南華大學病原生物學研究所保存。

1.1.2 主要儀器及試劑 細胞培養箱(Sanyo公司);生物安全柜(Haier公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司)和倒置顯微鏡(日本Nikon公司);兔抗衣原體屬多克隆抗體(D395)由本實驗室制備并保存,羊抗兔Cy2抗體購于Sigma公司;放線菌酮、慶大霉素和鏈霉素購自Sigma公司;Ct核酸定量檢測試劑盒購自達安基因診斷公司。

1.1.3 培養基 DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司,SPG轉運培養基參考《分子克隆實驗指南》第3版附錄部分配制。

1.2 方法

1.2.1 Ct血清型LGV L2體外培養 按照常規方法制備HEp-2細胞單層,棄培養液,用HBSS液洗2次,加入含有終濃度為30μg/mL DEAE葡聚糖的DMEM培養基,37℃溫箱孵育10 min;用HBSS液洗2次;將凍存于-70℃的Ct血清型LGV L2標準株在37℃水浴箱1 min內復蘇,用SPG稀釋后,接種到單層細胞上,每孔200μL,置于37℃溫箱孵育,每隔30 min輕輕搖晃1次,孵育2 h后棄去孔內液體,加入含有10%FBS的DMEM完全培養液,置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養,觀察被感染細胞和血清型LGV L2包涵體形態的變化。

1.2.2 Ct血清型LGV L2在不同細胞內的生長情況 按常規方法復蘇培養HeLa、HEp-2、Vero、HepG-2和SGC-7901細胞于24孔板中,待細胞形成80%左右的單層細胞,按前述方法接種感染復數(multiplicity of infection,MO I)為0.5的Ct血清型LGV L2,于37℃、5%CO2恒溫培養箱中分別孵育12、24、36和48 h后,進行間接免疫熒光抗體染色,熒光顯微鏡下觀察包涵體形態,在高倍鏡(40×)下隨機計數10個視野中IFU總數,取平均數,即為每個視野中的IFU數量;同時采用Real-Time PCR法定量檢測血清型LGV L2核酸量。

1.2.3 放線菌酮對血清型LGV L2生長發育的影響 將上述每種單層細胞分為A、B 2組,每種細胞每組12孔。分別感染MO I為0.5的Ct血清型LGV L2,A組細胞用含2μg/mL放線菌酮的DMEM完全培養基培養;B組用不含放線菌酮的DMEM完全培養基培養,于感染后12、24、36和48 h,進行熒光抗體染色,觀察包涵體形態,同時采用Real-Time PCR法檢測各孔血清型LGV L2核酸量,重復3次。

1.2.4 DEAE葡聚糖對Ct血清型LGV L2感染率的影響 制備上述每種單層細胞分為A、B 2組,每組3孔,A組各單層細胞用HBSS洗滌2次后,分別用含30μg/mL DEAE葡聚糖的無血清DMEM預處理10 min;B組單層細胞同步經HBBS洗滌后用無血清DMEM培養基預處理10 min,然后A、B 2組各單層細胞均用HBSS洗2次,接種MO I為0.5的Ct血清型LGV L2,置于37℃,5%CO2恒溫培養箱內孵育36 h,高倍鏡下隨機計數10個視野中IFU總數,計算每個視野中的IFU數量,同時測定各孔細胞中的血清型LGV L2核酸量。

1.2.5 熒光抗體染色 收集待染色標本,依次用4%多聚甲醛和0.5%的Triton X-100固定和打孔,PBS洗2次后,用含2%牛血清白蛋白的封閉液于4℃孵育過夜,棄封閉液后加入一抗(兔抗衣原體多抗D395)稀釋液,于4℃孵育過夜,用PBS洗3次后加入經稀釋后的二抗(羊抗兔Cy2),37℃避光孵育1 h,PBS洗滌3次后吹干;用鑷子夾出蓋玻片,倒扣于滴有8μL左右防熒光淬滅劑的載玻片上,熒光倒置顯微鏡下觀察結果并攝像。

1.2.6 Real-Time PCR檢測血清型LGV L2核酸量 Ct核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)按照操作說明配好反應體系后,將Real-T ime PCR反應條件反應管置于Agilent Technologies Stratagene Max3000自動熒光檢測儀進行反應并分析結果。

2 結果與分析

2.1 Ct血清型LGV L2體外培養

圖1 L2感染HEp-2細胞形態變化(200×)Fig.1 Morphologic change of HEp-2 afterL2 infection(200×)

圖2 Ct血清型L2包涵體(1 000×)Fig.2 Inclusion bodies ofL2 in HEp-2 cells(1 000×)

將血清型LGV L2接種于HEp-2單層細胞,培養20 h后即可在光學顯微鏡下觀察到細胞形態出現明顯變化,未感染細胞呈梭形或多邊形(圖1A);而感染細胞腫脹,折光性差,感染40 h后,細胞內可見較大包涵體,如箭頭所示(圖1B)。熒光抗體染色可見明顯包涵體(圖2)。

2.2 Ct血清型LGV L2在不同細胞內的生長情況

血清型LGV L2分別感染HeLa、HEp-2、Vero、HepG-2和SGC-7901細胞,培養12 h后熒光顯微鏡下各細胞株內可見綠色熒光小體;培養24 h后,發現各細胞株內血清型LGV L2包涵體均增大,但大小有明顯差異;孵育36 h后,HeLa細胞內部分包涵體破裂,其他各細胞株內血清型LGV L2包涵體不同程度增大;孵育至48 h,SGC-7901和HeLa細胞中包涵體基本完全破裂,其他3種細胞內均可見散在熒光小體,說明包涵體裂解釋放部分原體(圖3)。采用Real-Time PCR定量檢測孵育12、24、36和48 h后血清型LGV L2的核酸量,結果顯示HeLa細胞感染率最高,SGC-7901和HEp-2細胞次之,Vero細胞和HepG-2細胞感染率最低(圖4)。血清型LGV L2感染30 h后,分別計數5種細胞內包涵體數量(表1),采用單因素方差分析比較5種細胞內總體IFU均值差異,F=334 252.515,P<0.001,具有統計學意義,每2種細胞內IFU均數差異采用獨立樣本t檢驗分析,均有P<0.001,具有統計學意義,說明細胞類型影響血清型LGV L2的生長發育。

圖3 L2在不同細胞中的發育情況(1 000×)Fig.3 The development ofL2 in difference cell lines(1 000×)

圖4 Real-T ime PCR檢測各細胞內L2核酸量Fig.4 Quantity ofNucleic Acid ofL2 in different cells by Real-Time PCR

表1 感染30 h后5種細胞中血清型LGV L2包涵體數量Table 1 IFU ofLGV L2 in five cell lines after 30h post infection

HeLa組與HEp-2組比較t=1 075.915,P<0.01;與Vero組比較t=999.392,P<0.01;與SGC-7901組比較t=316.887,P<0.01;與HepG-2組比較t=1 266.466,P<0.01。HEp-2組與Vero組比較t=188.227,P<0.01;與SGC-7901組比較t=308.164,P<0.01;與HepG-2組比較t=301.287,P<0.01。Vero組與SGC-7901組比較t=382.571,P<0.01;與HepG-2組比較t=232.415,P<0.01。SGC-7901組與HepG-2組比較t=424.852,P<0.01。

2.3 放線菌酮對血清型LGV L2生長發育的影響

細胞感染血清型LGV L2后,分別用含放線菌酮的DMEM完全培養基和不含放線菌酮的DMEM完全培養基培養。間接免疫熒光染色發現,放線菌酮培養組各細胞內血清型LGV L2包涵體開始裂解時間較對照組早,如在Vero細胞中,放線菌酮組孵育36 h后有散在熒光小點(圖5A),說明部分包涵體裂解,而對照組細胞內未見散在熒光小點(圖5B)。Real-T ime PCR檢測結果顯示,含放線菌酮培養組各細胞內血清型LGV L2核酸量較對照組大(圖6)。

圖5 L2型感染Vero細胞36 h后熒光抗體染色Fig.5 Inclusions bodies ofL2 in Vero cells at 36 h post-infection

圖6 Real-T ime PCR檢測HeLa細胞內L2核酸量Fig.6 Quantity ofNucleic Acid ofL2 in HeLa cells by Real-Time PCR

2.4 DEAE葡聚糖對血清型LGV L2感染的影響

表2 不同處理組5種細胞內血清型LGV L2包涵體數量(IFU/視野)Table 2 IFU ofLGV L2 in five cell lines in different treated groups

圖7 Real-T ime PCR檢測5種細胞內L2核酸量Fig.7 Quantity ofNucleic Acid ofL2 in Five cell lines by Real-Time PCR

DEAE預處理組和對照組各細胞接種Ct血清型LGV L2,培養30 h后,間接熒光抗體染色,計數IFU,采用獨立樣本t檢驗比較IFU均值,發現2組各細胞內IFU沒有明顯差異(表2)。Real-T ime PCR檢測培養12 h后各細胞內血清型LGV L2的核酸量,發現DEAE對血清型LGV L2的感染沒有明顯影響(圖7)。

3 討 論

人類是血清型LGV L2的唯一宿主,在體內主要感染上皮細胞和巨噬細胞。在體外培養時,血清型LGV L2可在雞胚卵黃囊中增殖,也可感染人類與非人類的上皮細胞和成纖維細胞[12]。本實驗選用了上皮細胞包括HeLa細胞、HEp-2細胞和Vero細胞,另外還選擇了類上皮樣生長的HepG-2細胞和SGC-7901細胞。用血清型LGV L2分別感染這5種細胞,間接免疫熒光染色結果顯示,5種細胞均能感染血清型LGV L2。有文獻報道血清型LGV L2完成周期的時間與其他衣原體不一樣,其生長速度比其他沙眼衣原體快,感染后約18～24 h可見包涵體[12]。本實驗在接種血清型LGV L2大約24 h后,各細胞內均可見到包涵體,與文獻報道基本一致[9]。

不同細胞感染血清型LGV L2后,分別于培養12、24、36和48 h后進行間接免疫熒光抗體染色。結果顯示,HeLa細胞在培養36 h后,細胞內部分包涵體裂解,48 h時包涵體基本完全裂解;SGC-7901細胞內包涵體在感染后約44～48 h裂解,HEp-2細胞中在48 h左右開始裂解,Vero細胞在48 h未見裂解現象,但是包涵體密度減小,而在HepG細胞內包涵體在48 h時仍較致密,說明血清型LGV L2的生長周期與細胞類型有一定的關系。通過Real-Time PCR定量檢測血清型LGV L2核酸量,發現Hela細胞感染率最高,SCG-7901和HEp-2細胞次之,Vero細胞和HepG-2細胞感染率最低,采用單因素方差分析和t檢驗比較5種細胞內IFU,發現各細胞間有統計學意義,說明血清型LGV L2在感染過程中存在一定的細胞嗜性。

目前國內外在培養血清型LGV L2時,各實驗室沒有統一的方法。有些文獻報道,在接種血清型LGV L2前需用DEAE葡聚糖對宿主細胞進行預處理,以抑制宿主細胞蛋白質的合成,從而優化衣原體的生長代謝環境,增加血清型LGV L2的感染率[12]。但有些文獻明確指出,血清型LGV L2具有較強的侵襲性,在接種過程中,不需要采用化學方法和機械輔助增強感染率,在培養過程中也不需要添加放線菌酮[9]。為此本實驗比較放線菌酮和DEAE葡聚糖對血清型LGV L2生長情況的影響。結果顯示含放線菌酮培養組各細胞內包涵體開始裂解的時間比對照組早,如含放線菌酮培養組HeLa細胞中包涵體在36 h左右開始裂解,而對照組HeLa細胞內包涵體在約40 h才開始裂解;Real-Time PCR結果顯示含放線菌酮培養組各細胞內血清型LGV L2核酸量較對照組多,說明放線菌酮可以促進血清型LGV L2的生長。而DEAE葡聚糖處理組與未處理組的各細胞內血清型LGV L2核酸量和IFU沒有明顯差異,說明DEAE葡聚糖對血清型LGV L2的生長沒有明顯影響,與Scidmore等[9]報道一致,說明血清型LGV L2較其他衣原體具有更強的侵襲力,無需機械設備或者化學試劑輔助,即可入侵細胞。本實驗初步研究了HeLa等5種細胞對血清型LGV L2的敏感性及DEAE葡聚糖和放線菌酮對血清型LGV L2生長發育的影響,為臨床標本中血清型LGV L2的分離培養和進一步研究血清型LGV L2的相關實驗奠定了基礎。

[1] Kapoor S.Reemergence of lymphogranuloma venereum[J].Eur Acad DermatolVenereol,2008,22(4):409-416.

[2] Richardson D,GoldmeierD.Lymphogranulom a venereum:an emerging cause of proctitis in men who have sexwith men[J].Int J STD A IDS,2007,18(1):11-14.

[3] Linus Christerson,Henry JC,de Vries,et al.Typing ofLymphogranuloma VenereumChlamydia trachomatisStrains[J].Emerg InfectDis,2010,16(11):1777-1779.

[4] Georg Stary,Thomas Meyer,Christine Bangert.New Chlamydia trachomatisL2 Strains Identified in a Recent Outbreak of Lymphogranuloma Venereum in Vienna[J].Sexually Trans mitted Diseases,2008,35(4):377-382.

[5] McLean CA,StonerBP,Workowski KA.Treatmentof lymphogranuloma venereum[J].Clin InfectDis,2007,44(Suppl 3):S147-152.

[6] Aral SO,OverM,ManhartL,et al.Sexually Trans mitted Infections-Disease Control Prioritiesin Developing Countries[M].2nd edition.Washington(DC):World Bank;2006,Chapter 17.

[7] Van de LaarMJ,Koedijk FD,Gotz HM,et al.A slow epidemic ofL GV in the Net herlands in 2004 and 2005[R].Euro Surveill,2006,11(9):150-152.

[8] Gordon FB.Quan AL.Isolation of the trachoma agent in cell culture[J].Proc Soc Exp BiolMed,1965,118:354-359.

[9] Scidmore MA.Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis[M].Curr Protoc Microbiol,2005,Chapter 11:Unit 11A.1.

[10] MA Chernesky.The laboratory diagnosisofChlamydia trachomatisinfections[J].Can J Infect Dis Med Microbiol,2005,16(1):39-44.

[11] J Malathi,G Shyamala,HN Madhavan.Relative susceptibility of six continuous cell lines for cultivation ofChlamydia trachomatisstrains[J].Indian Journal of Medical Microbiology,2004,22(3):169-171.

[12] Miyairi I,MahdiOS,Ouellette SP,et al.Different growth rates ofChlamydia trachomatisbiovars reflect pathotype[J].J Infect Dis,2006,194(3):350-357.