紅曲多糖液態發酵條件與抗氧化活性的研究

汪鵬榮,陳攀攀,藍麗精,蔣冬花,林遙雪

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發酵液中分離出的由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的不溶于高濃度乙醇、正丁醇及丙酮等有機溶劑的高分子多聚物,與動、植物多糖不同,真菌多糖分子單體之間主要以β-1,3與β-1,6糖苷鍵結合,形成鏈狀分子,具有螺旋狀的立體構型[1]。自1970年日本千原羽田從香菇中分離出一種抗腫瘤的多糖后,科學界掀起了食用真菌多糖研究的熱潮。真菌多糖在國際上被稱為“生物反應調節物”(biological response modifier,簡稱BRM),具有很大的應用開發價值。大量的藥理實驗表明,真菌多糖具有還原能力,可以消除體內的自由基,具有抗氧化性,因而具有刺激免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性,己經被廣泛應用于醫療保健領域[2]。目前,已在國內臨床應用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝肽多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等[3]。紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌,紅曲霉發酵制成的中藥紅曲具有活血化瘀、健脾消食等功效及降脂、降壓、降糖和抗腫瘤等作用[4],在食品、色素、中藥等領域也有廣泛的應用,隨之紅曲霉的次級代謝產物也成為研究焦點[5]。多糖類物質是紅曲霉所含有的重要化學成分之一,相關研究表明紅曲多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等多種功能[6-8]。紅曲多糖可像靈芝多糖一樣通過液態發酵而實現工業化生產,但目前國內對紅曲多糖的發酵生產工藝研究不多,相關報道的胞外多糖產量普遍較低,尚處于探索階段。通過從不同環境中采集來的紅曲米中分離篩選出1株高產胞外多糖紅曲霉菌株Mr-70,對其培養基組分及液態發酵條件進行優化,并進一步對胞外粗多糖清除DPPH自由基的能力進行了研究,以期為紅曲多糖的工業化生產及應用提供理論和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 紅曲霉菌株Mr-70分離自浙江金華地區采集來的紅曲米。

1.1.2 培養基 ①斜面培養基(PDA培養基):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,pH自然(固體培養基加瓊脂粉18 g);②種子培養基[9]:葡萄糖50 g,蛋白胨5 g,酵母膏1 g,KH2PO41 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,水1 000 mL,pH 6.0;③發酵培養基(g/L):葡萄糖50,蛋白胨20,KH2PO4·3H2O 8,MgSO40.5,pH 6.0。

1.1.3 試劑 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)、甲醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、番薯粉、乳糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、無水乙醇,均為國產分析純;試驗用水為去離子水。

1.1.4 實驗設備 LRH-280生化培養箱,廣東醫療器械廠;C24KC生物恒溫搖床,CERTIFIED;M IKRO-22R高速冷凍離心機,德國Hettichi公司;UV-7504紫外可見分光光度計,上海欣茂儀器公司;DHG-9101.28A電熱恒溫鼓風干燥箱,山東鄄城科源儀器設備廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋,山東鄄城科源儀器設備廠;JA3003A天平,上海精天電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 將保存的紅曲霉菌株Mr-70用接種針接入斜面培養基,30℃恒溫培養5 d。

1.2.2 種子液制備 用打孔器(直徑0.8 cm)取30℃培養5 d的平板菌種5塊分別接種到種子培養基中(250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養基),30℃,于200 r/min的旋轉式搖床培養48 h。

1.2.3 液體發酵培養 將培養48 h的種子液接種到液體發酵培養基中,接種量為8%,250 mL三角瓶裝100 mL培養液,180 r/min、30℃培養96 h,最后取發酵液分析檢測粗多糖的產量。

1.2.4 發酵液中多糖含量的測定[10-11]發酵濾液定容至100 mL,取適量發酵液,5 000 r/min離心30 min,將所獲上清液抽濾,除去其中的不溶物,取上清液15 mL加入60 mL無水乙醇中,在5℃下靜置8 h過濾,沉淀在80℃烘干12 h至恒重,稱量即為胞外粗多糖含量。

1.2.5 胞外粗多糖清除DPPH的測定方法[12-13]DPPH·是一種在有機溶劑中非常穩定的自由基,呈紫色,不溶于水,可溶于甲醇溶液,在517 nm處有一個特征吸收峰,當其遇到自由基清除劑時,與DPPH的孤電子配對,使其顏色變淺,在最大吸收波長處的吸光度變小。配制不同濃度的粗多糖溶液,離心取2 mL上清于試管中,再加入2 mL DPPH的甲醇溶液(DPPH濃度為1×10-4mol/L),混合均勻,0.5 h后用分光光度計在517.4nm處測定其吸光度Ai;同時測2 mL DPPH溶液+2 mL甲醇混合后的吸光度A0和2 mL提取液+2 mL甲醇混合后的吸光度Aj,實驗中每個濃度平行做3次,取其平均值。按下式計算對自由基的清除率:

2 結果與分析

2.1 碳源對胞外多糖產量的影響

以液體發酵培養基為基礎,分別采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、番薯粉、乳糖為碳源進行試驗(碳源質量濃度設定為50 g/L),將紅曲霉菌Mr-70接入上述各發酵培養基中,30℃條件下,以200 r/min的速度搖瓶培養96 h,對發酵液中的多糖含量和菌體生物量進行初測,實驗重復3次。實驗結果顯示(表1),紅曲霉菌Mr-70利用以上6種物質產胞外多糖的能力依次是葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖>番薯粉>淀粉,其中以葡萄糖為唯一碳源時的胞外多糖產量最高達5.63 g/L,而從菌絲體產量來看葡萄糖和麥芽糖是最適合紅曲霉生長的碳源,因此確定葡萄糖為最適碳源。

表1 不同碳源對M r-70發酵產胞外多糖能力的影響Table 1 The effects of carbon sources on the MEP yield of Mr-70

2.2 氮源對胞外多糖產量的影響

以液體發酵培養基為基礎,分別采用蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、尿素為氮源進行試驗(氮源質量濃度設定為20 g/L),將紅曲霉菌Mr-70接入上述各發酵培養基中,30℃、200 r/min搖瓶培養96 h,對發酵液中的多糖含量和菌體生物量進行初測。由表2顯示有機氮源比無機氮源更有利于紅曲霉菌Mr-70的生長,其中蛋白胨和酵母膏對菌絲體生長最有利,但是蛋白胨是最佳產胞外多糖所需的氮源,因此,選擇蛋白胨作為紅曲霉菌Mr-70的最適氮源。

表2 不同氮源對M r-70發酵產胞外多糖能力的影響Table 2 The effects of nitrogen sources on theMEP yield ofMr-70

2.3 碳氮比對胞外多糖產量的影響

以液體發酵培養基為基礎,在上述碳氮源實驗的基礎上,分別選取碳氮比(質量比)1◇1、2◇1、3◇1、4◇1、5◇1、6◇1進行碳氮比篩選實驗。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類碳氮比不同的發酵培養基中,30℃、200 r/min搖瓶培養96 h,對發酵液中的多糖含量進行初測,實驗重復3次。由圖1可知,紅曲霉菌Mr-70菌絲體的產量隨碳氮比的增加而增加;胞外多糖產量先隨著碳氮比的增加而增加,當碳氮比為3◇1時達到最大值8.40 g/L,然后隨著碳氮比的增加多糖產量反而下降。過高的碳氮比只適合菌體的生長卻不利于菌體分泌胞外多糖,過低則會影響菌體的生長和胞外多糖的分泌,因此紅曲霉菌Mr-70最適產胞外多糖的碳氮比初步確定為3◇1。

圖1 不同碳氮比對紅曲霉菌M r-70菌絲體生長和產胞外多糖的影響Fig.1 The effects of ratio ofm(C):m(N)on theMEP yield ofMr-70

2.4 無機鹽濃度對胞外多糖產量的影響

以上述最適碳氮比為基礎配制液體發酵培養基,分別選取不同濃度的無機鹽添加量:KH2PO4·3H2O(2、4、6、8、10、12 g/L)、MgSO4(0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 g/L)進行最適無機鹽濃度篩選實驗。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類無機鹽濃度不同的發酵培養基中,30℃、200 r/min搖瓶培養96 h,對發酵液中的多糖含量進行初測,實驗重復3次。無機鹽是微生物生長和產代謝產物必須的營養物質。培養基中無機離子種類與濃度對微生物胞外多糖的合成有重要影響,并同時影響胞外多糖的化學組成和物性[14]。其中P、S、K、Mg 4種礦質元素必須通過外界添加才可達到菌體生長所需濃度,對于這幾種元素來源,首選KH2PO4·3H2O和MgSO4,可以同時提供這4種元素[15],因此有必要通過實驗確定KH2PO4·3H2O和Mg-SO4的最適添加量,實驗結果見圖2。由圖2可知,無機鹽濃度對紅曲霉菌絲體生長的影響不太明顯,但對胞外多糖產量的影響卻很明顯,當Mg-SO4和KH2PO4·3H2O濃度分別為1.1 g/L(圖2a)、10 g/L(圖2b)時多糖產量達到最大值8.56 g/L。

圖2 無機鹽添加量對胞外多糖產量的影響Fig.2 The effects of concentrations of KH2PO4·3H2O andMgSO4on theMEP yield ofMr-70

2.5 培養基起始pH對胞外多糖產量的影響

圖3 培養基起始pH值對胞外多糖產量的影響Fig.3 The effects of initial pH on theMEP yield ofMr-70

將菌種接入液體發酵培養基中,以3.5為初始pH,0.5一個梯度,逐漸增加至7.0,通過對不同初始pH值的測試,獲取最佳初始pH。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類起始pH不同的發酵培養基中,30℃、200 r/min搖瓶培養96 h,對發酵液中的多糖含量進行初測,實驗重復3次。多糖的合成在多種酶的共同催化作用下完成,pH可影響培養基中有效成分的溶解性及運輸、相關酶活性、副產物的形成及發酵過程中的氧化還原反應,從而影響微生物的生長與代謝[16]。由圖3可知,酸性環境更有利于菌絲體生長,卻不利于胞外多糖的產生,當pH為6.5時紅曲霉Mr-70胞外粗多糖產量達到最大值8.7 g/L。

2.6 搖床轉速對胞外多糖產量的影響

將紅曲霉菌Mr-70接入液態發酵培養基中,以最佳pH值為條件。選取0、50、100、150、200、250 r/min 6個轉速梯度,測試Mr-70產胞外多糖的最佳搖床轉速。大多數產胞外多糖的微生物需氧才能合成胞外多糖,故發酵過程中通氣極為重要,過高或者過低都不利于菌絲體生長,進而影響胞外多糖產量。紅曲霉是一種好氧真菌,本實驗通過改變轉速來改變搖瓶通氣量,由圖4可知,紅曲霉菌絲體的生長隨著搖床轉速的增加而增加,當搖床轉速為250 r/min時菌絲體量達到最大值21.04 g/L;搖床轉速在50～200 r/min時,多糖產量隨著搖床轉速的增加而增加,但是過高的氧氣含量卻不利于胞外多糖的產生,當搖床轉速為200 r/min胞外粗多糖產量達到最大值9.33 g/L。

圖4 搖床轉速對胞外多糖產量的影響Fig.4 The effects of rotation speeds on theMEP yield ofMr-70

2.7 搖瓶溫度對胞外多糖產量的影響

將紅曲霉菌Mr-70接入液態發酵培養基中,以最優pH和最優搖床轉速為條件,測試從20～40℃下不同的胞外多糖產量,以確定最佳搖瓶溫度。微生物的生命活動都是由一系列生物化學反應組成的,這些反應都要在各種酶的催化下進行,而溫度是保證酶活性的重要因素,因此,在發酵過程中保證穩定合適的溫度具有重要意義[17]。溫度可以影響微生物體內的各種化學反應的進行,進而影響微生物的生長和各種代謝產物的積累,因此每種微生物都有其最適的生長溫度和最適的產胞外多糖溫度。由圖5可知,當搖瓶溫度在20～36℃之間時,菌絲體的產量隨著溫度的增加而增加,當溫度高于36℃時菌絲體產量開始緩慢下降;而胞外多糖產量在溫度為32℃時達到最大值10.15 g/L,因此紅曲霉菌Mr-70的最適生長溫度(36℃)與其最適產胞外多糖溫度(32℃)不完全一致。

圖5 搖瓶溫度(℃)對胞外多糖產量的影響Fig.5 The effects of temperature on the MEP yield of Mr-70

2.8 粗多糖的抗氧化活性測定結果

圖6 不同濃度的胞外粗多糖對DPPH·的清除作用Fig.6 The scavenging effect ofMEP on DPPH·

DPPH·分析法被廣泛用于清除自由基物質活性的研究,可評價有機清除劑的活性[18]。不同濃度的胞外粗多糖的DPPH·清除能力見圖6。由圖6可知,當粗多糖濃度在0.5～2 mg/mL時,對DPPH·的清除能力呈現對數增長趨勢;當粗多糖濃度超過2 mg/mL時,對DPPH·的清除能力增加緩慢。Tseng等[19]從靈芝中提取的多糖,在濃度為5 mg/mL時,對DPPH·清除率為36.4%～58.4%;葉明等[20]從黑芝胞外提取的多糖,在濃度為40 mg/mL時對DPPH·清除率為23.4%,而5 mg/mL的紅曲霉胞外粗多糖的DPPH·清除率就達82.24%,因此,紅曲霉胞外粗多糖表現出較強的DPPH·清除能力。

3 結 論

通過對紅曲霉液體發酵生產條件進行研究,初步得出紅曲霉菌Mr-70產胞外多糖的最適培養條件:葡萄糖60 g/L,蛋白胨20 g/L,K2HPO410 g/L,MgSO4·7H2O 1.1 g/L,發酵液起始pH 6.5,32℃、200 r/min搖床培養96 h,紅曲霉菌株Mr-70的胞外粗多糖產量可達10.15 g/L。

二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)是一種很穩定的以氮為中心的自由基,若樣品能清除它,則提示樣品具有降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質過氧化鏈反應的作用[21]。紅曲霉胞外粗多糖對DPPH·具有較強的清除能力,表明紅曲霉胞外粗多糖具有良好的體外抗氧化活性,而且紅曲霉胞外粗多糖是一種天然提取物,具有成本低廉、安全無毒等特點,因此,紅曲霉胞外粗多糖作為天然抗氧化劑具有很好的開發應用前景。

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