弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定與PCR-SSCP分析

胡秀彩,王 藝,呂愛軍

(徐州師范大學生命科學學院,江蘇徐州 221116)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是中國主要食用經濟魚類之一。近年來草魚養殖規模和產量快速發展,同時細菌性病原感染給草魚養殖業帶來了巨大的經濟損失[1]。隨著河流、海洋環境的污染,人畜共患病原菌開始感染魚類,已報道從魚類等水生動物中分離到氣單胞菌(Aerom onas)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、假單胞菌(Pseudom onas)等多種人畜共患病原菌[2-5]。最近Akoachere等[6]從沿海魚類的腸道、鰓等組織中分離到大腸埃希菌(Escherichiacoli)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter fruendii)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)等人類致病菌,證實對氨芐青霉素耐藥率達45.7%。弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)是一種“人-獸-魚”共患病病原菌,可引起人、哺乳動物、魚、鱉、蝦等感染發病[7-11]。目前關于魚類腸道中弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定研究,國內外鮮有報道[4]。本研究以草魚為實驗對象,從其腸道中分離到3株弗氏檸檬酸桿菌,并進行形態學觀察、生理生化特征、藥敏試驗、動物試驗、構建系統發育進化樹及PCR-單鏈構象多態性分析(PCR-single strand conformation polymorphism,SSCP),為魚類疾病診斷防治提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 草魚購自徐州市某菜市場,隨機選取體重約500 g左右的草魚用于細菌分離;斑馬魚(平均體重約0.25 g)購自徐州市某花鳥市場;小鼠(平均體重22 g)購自徐州醫學院實驗動物中心。

1.1.2 培養基 麥康凱瓊脂(MaC)、伊紅美藍瓊脂(EMB)、三糖鐵瓊脂(TSI)培養基、常規細菌微量生化鑒定管、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ-15e、藥敏紙片等購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要試劑 革蘭陰性菌基因組提取試劑盒、PCR引物、TaqDNA聚合酶、dNTP等購自上海捷瑞生物工程公司,pMD18-T Vector試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、形態觀察與生化試驗 無菌操作取草魚中后部腸道,用無菌生理鹽水沖洗3次,刮取魚腸內容物,加無菌生理鹽水于離心管中混勻后300 r/min離心5 min,吸取適量上清液涂布普通營養瓊脂、MaC平板,29℃培養24 h,挑取菌落形態特征不同的單個菌落進行分離純化,獲得純種轉接試管斜面培養基上保存、備用。獲得菌株經革蘭染色,在光學顯微鏡下觀察;同時挑取單菌落,用4%的戊二醛固定1 h,PBS洗3次,再用4%的戊二醛固定30 min,PBS洗3次,乙醇梯度脫水,最后加叔丁醇脫水,在H ITACH I S-3400N掃描電子顯微鏡下觀察細菌形態特征。取純培養菌,分別劃線接種于普通營養瓊脂、MaC、EMB、TSI培養基平板,29℃培養24 h,分別檢查生長情況及菌落特征。細菌微量生化鑒定參照文獻[12]方法進行,并連續觀察7 d。

1.2.2 細菌總DNA提取、16S r DNA基因的PCR擴增及系統發育樹分析 采用革蘭陰性菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA,經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將3株菌的總DNA于-20℃保存備用。以總DNA為模板,采用細菌通用引物進行16S rDNA基因擴增,正向引物:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′,反向引物:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。10μL反應體系分別包括:5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.1μL,10×buffer 1μL,25 mmol/L的MgCl20.6μL,2.5 mmol/L的dNTP混合物0.2μL,引物各0.3μL,模板DNA 0.4 μL,無菌雙蒸水7.1μL。PCR反應條件:94℃預變性4 min、94℃變性30 s、57℃復性30 s、72℃延伸1 min,30個循環后72℃延伸10 min。PCR產物連接pMD18-T載體,轉化大腸埃希菌DH5α篩選陽性克隆,送上海生工生物工程有限公司測序。將3株菌的16S rDNA基因序列通過NCB I的Blast檢索系統(http://www.1ncbi1nlm1nih1gov/Blast/)進行序列同源性分析,使用ClustalX1.8軟件與從GenBank數據庫中獲得的細菌16S r DNA基因序列進行多序列匹配排列(Multiple Alignments),采用鄰接法(Neighbor joiningmethod)構建系統發育樹,并通過1 000次的自舉分析(boost rap)進行置信度檢測。

1.2.3 16S r DNA基因V3區的PCR-SSCP分析

以總DNA為模板,正向引物:5′-CAGTCACGACGTTGTAA-3′,反向引物5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。10μL反應體系包括:5 U/μL的TaqDNA聚合酶0.1μL,10×buffer 1μL,25 mmol/L的MgCl20.6μL,2.5 mmol/L的dNTP混合物0.2μL,引物各0.3μL,模板DNA 0.4μL,無菌雙蒸水7.1μL。PCR反應條件:94℃預變性4 min、94℃變性30 s、51℃復性30 s、72℃延伸1 min,30個循環后72℃延伸10 min。PCR擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。SSCP分析參考文獻[13]進行。簡述如下:取6μL的PCR產物,與4μL變性緩沖液混勻,98℃變性10 min后立即冰浴10 min,于10%PAGE中電泳,4℃、180 V電泳2.5 h(Bio-Rad);電泳后先用蒸餾水洗1～2次,0.1%AgNO3染色15 min,然后利用2.0%NaOH(0.2%甲醛)顯色,直至條帶清晰為止;照像并分析SSCP帶型。

1.2.4 動物試驗與藥敏試驗 小鼠試驗以3株菌29℃培養24 h,制備終濃度為9×108cfu/mL的菌液,小鼠腹腔注射0.2 mL,每株細菌注射3只,觀察7 d,記錄結果。死亡的小鼠無菌操作取臟器接種營養瓊脂平板上,觀察有無相應的細菌生長。對照組注射無菌生理鹽水,劑量相同;斑馬魚感染實驗分為飼養溫度25、28℃2組,采用菌濃度為108cfu/mL的TC-2菌株進行浸泡感染試驗,浸泡時間為10 min,每組5條斑馬魚,連續觀察7 d,實驗重復3次,統計致死率,對照組用等量0.65%氯化鈉溶液同樣處理。藥敏試驗采用紙片擴散法,無菌操作將藥敏紙片分別置于含菌LB瓊脂平板上,每種藥3個重復,根據藥敏試驗判斷標準,確定病原菌對不同藥物的敏感程度。

2 結果與分析

2.1 菌體形態及培養特征

3株菌均為革蘭陰性桿菌、無芽胞、大小約為(0.5～1.0)μm×(1.0～2.5)μm,在普通光學顯微鏡下多呈分散或成對排列,在掃描電鏡觀察3株菌菌體呈桿狀(有的菌體稍彎曲)、2端鈍圓(圖1)。3株分離菌在營養瓊脂平板上菌落呈圓形光滑、濕潤、隆起、半透明、乳白色、邊緣整齊,直徑多在1.5 mm;在MaC平板上培養24 h后形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的菌落,直徑多在2.0 mm左右,TC-1菌株菌落呈紅色,TC-2菌株菌落呈白色,TC-3菌株菌落呈白色中間帶紅點;在EMB平板上培養24 h后形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的菌落,TC-1菌株直徑多在1.5 mm,菌落呈紫黑色,TC-2菌株直徑多在1.5 mm,菌落呈灰黑色,TC-3菌株直徑多在1.0 mm,菌落呈灰白色;在TSI平板上培養24 h后形成圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起的黃色菌落,直徑多在3.0 mm;TC-1、TC-3菌株在TSI瓊脂高層斜面下部呈黑色、斜面呈黃色,TC-2菌株在TSI瓊脂高層斜面下部呈黑色、斜面呈紅色。

2.2 生化特征

3株菌生化特性結果見表1,查閱《伯杰氏系統細菌學手冊》[14],結果表明菌株TC-1、TC-2及TC-3的形態學特征和各項生理生化檢測結果基本符合檸檬酸桿菌屬的特性,初步確定為檸檬酸桿菌屬(Citrobacter);進一步查詢腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌生化數值編碼表,3株菌株鑒定均為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter fruendii)。

圖1 3株分離菌的掃描電鏡照片(標尺=0.5μm)Fig.1 Scanning electron micrograph of the three isolated strains(bar=0.5μm)

2.3 菌株16S rDNA序列、PCR-SSCP和系統發育學分析

分離菌株TC-1、TC-2和TC-3 PCR擴增的16S rDNA序列長度為1 505 bp,在GenBank中登錄號為HQ399663。將3個分離菌株的16S rDNA基因序列通過NCB I的Blast軟件進行序列同源性檢索,結果其與檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)等腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌的16S r DNA基因序列自然聚類,在檢索出的弗氏檸檬酸桿菌等細菌序列中,3個分離菌株與弗氏檸檬酸桿菌DS M 30039模式株同源性分別為99.59%、99.47%和99.53%,與其他菌株的同源性在96%～99%,TC-1、TC-2和TC-3均為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii),這與3菌株的生化表型鑒定結果一致。以弗氏檸檬酸桿菌(AJ233408)16S rDNA基因為參照序列,對3株分離細菌16S rDNA基因高變區V3區序列比對,Blast搜索發現5個SNP突變位點,即449C→T,461T→C,469G→A,471G→A,479C→T;進一步采用PCR-SSCP分析表明,菌株TC-1、TC-2和TC-3的16S rDNA V3區呈現基因多態性,具有不同的SSCP指紋圖譜,其中TC-1菌株與TC-2、TC-3菌株SSCP帶型明顯不同,菌株TC-2、TC-3之間的SSCP帶型有微弱差異,結果表明弗氏檸檬酸桿菌SSCP圖譜中菌株之間帶型存在一定差異(圖2),這與16S rDNA V3序列分析結果一致。在GenBank中選取了其中16株細菌的16S rDNA基因序列進行系統發育學分析,結果顯示3個分離菌株基本屬于同一個分支類群中,其中TC-1菌株與TC-2、TC-3菌株親緣關系較遠,TC-2與TC-3菌株親緣較近,系統發育樹見圖3。

表1 3株分離細菌的生化特征Table 1 Biochemical characteristics of the three isolated strains

圖2 3株菌16S rDNA V3區的PCR-SSCP分析Fig.2 PCR-SSCP analysis of the 16S rDNA V3 region of 3 strains

2.4 動物試驗

對3株分離菌株分別進行動物感染實驗,結果發現僅有TC-2菌株對小鼠、斑馬魚有致死性。小鼠在注射24～36 h后全部死亡,死亡率為100%,感染發病死亡的小鼠腸道黏膜淤血、出血明顯。將TC-2株對斑馬魚浸泡感染試驗,結果表明當飼養溫度為25℃時,24～96 h致死率為66.7%;當飼養溫度升為28℃時,致死率為86.7%。感染發病死亡的斑馬魚呈現皮膚、腮部出血,腹部膨脹等癥狀。

2.5 藥敏試驗

用9類18種藥物對3株菌株進行藥物敏感性測試,結果表明對頭孢噻肟、頭孢曲松、洛美沙星、諾氟沙星等多種藥物敏感,見表2。

圖3 3株菌16S rDNA基因序列構建的N J樹(▲代表分離株)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of 3 strains(▲indicates the isolates)

表2 藥敏試驗結果Table 2 Results of drug sensitivity test

3 討 論

弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)為腸桿菌科、檸檬酸桿菌屬的成員,在土壤、水體、污水、食物中廣泛分布,此外在哺乳動物、鳥類、爬行動物和兩棲動物等體內也可分離得到,一般認為弗氏檸檬酸桿菌是原發性或繼發性感染的病原菌[14]。近年來,關于弗氏檸檬酸桿菌導致魚類感染疾病的報道不斷增加[15-16]。Sato等[17]最早從水族箱養殖的翻車鲀(M ola m ola)分離到弗氏檸檬酸桿菌,感染發病表現皮膚腐爛、出血、腸炎等癥狀。Toranzo等[18]報道魚源弗氏檸檬酸桿菌不能導致小鼠感染發病。Svetlana等[2]報道弗氏檸檬酸桿菌可引起虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腸炎,導致較高的死亡率。舒新華等[19]報道弗氏檸檬酸桿菌感染烏鱧(Ophiocephalus argus Cantor)導致腹水病。陳翠珍等[20]研究表明弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards)感染。本研究從草魚腸道中分離獲得3株弗氏檸檬酸桿菌,其中TC-2菌株對斑馬魚有致病性,感染引起斑馬魚(Danio rerio)皮膚、腮部出血,腹部膨脹等癥狀,并且感染與水溫有關。因此推測TC-2菌株疑似為草魚腸道中的條件致病菌,有可能由水中進入草魚腸道后再大量增殖,在水溫等環境條件改變時從而導致草魚感染發病。

陳翠珍等[20]對引起中華絨螯蟹死亡的3株弗氏檸檬酸桿菌進行藥敏試驗,結果顯示均對頭孢噻肟、頭孢曲松、諾氟沙星、氧氟沙星等藥物敏感;對利福平、頭孢唑啉、新生霉素等耐藥。林啟存等[21]對引起中華鱉(Pelodiscus sinensis)敗血癥的弗氏檸檬酸桿菌進行藥敏試驗,結果表明對復方新諾明、四環素耐藥,而對慶大霉素、丁胺卡那等藥物敏感。Nawaz等[4]對鯰魚(Ictalurus punctatus)腸道中檸檬酸桿菌藥敏試驗結果顯示對利福平、紅霉素等耐藥。本實驗對3株弗氏檸檬酸桿菌進行藥敏試驗,獲得結果與以上報道基本一致,但對環丙沙星、慶大霉素、紅霉素等藥物敏感性存在明顯差異,這可能與臨床用藥導致耐藥菌株不同有關。以上結果為臨床治療魚病合理選擇抗生素或減少抗生素濫用提供一定科學參考。

王永等[22]對常見食源性致瀉大腸埃希菌(D iarrheogenic Escherichiacoli)、沙門菌(Salm onellae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)進行SSCP分析,結果表明4種致病菌16S r DNA單鏈構象多態性具有種屬特異性。羅雯等[23]通過PCR-SSCP等分子技術快速鑒別了金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(V ibrio parahem olyticus)、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、銅綠假單胞菌(Pseudom onas aeruginosa)等10種常見病原菌。Schwieger等[24]研究表明PCR-SSCP方法可以應用于植物土壤微生物與根際微生物群落分析。Nair等[25]報道沙門菌(Salm onella)不同的血清型呈現不同的SSCP圖譜。最近,Takahashi等[26]將PCR-SSCP技術成功用于魚類細菌的檢測和鑒定。本實驗結果表明,3株弗氏檸檬酸桿菌的SSCP圖譜在條帶數目、相對遷移率及條帶間距方面,相互間均存在明顯差異,且其差異似與親緣關系成正比,即親緣關系越遠,差異越明顯,這與16S rDNA V3區序列多態性分析結果基本一致。SSCP是近年來發展起來的一種簡便、快速的基因突變分析技術,在動物腸道細菌鑒定中應用較多,目前在魚類中報道較少[26]。本研究表明弗氏檸檬酸桿菌16S r DNA V3區的PCR-SSCP圖譜具有很好的菌株鑒別效果,因此在魚類病原菌診斷中值得推廣應用。

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