2種蓼科植物體外抑菌試驗研究

林燕文

(惠州學院生命科學系，廣東惠州516007)

水蓼(Polygonum hydropiper L.)、火炭母(Polygonum chinense L.)均為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum L.)植物，是我國傳統的中藥材，都有清熱解毒、止血止痛的藥用作用［1-2］。水蓼又名辣蓼，為一年生草本植物，全草及根含揮發油、萜類、黃酮及黃酮苷類等成分［3-4］。火炭母又名清飯藤、火炭藤、赤地利、川七等，為多年生草本植物，其主要化學成分有黃酮類、鞣質、甾醇類等［5-6］。這2種蓼科植物在我國南方地區廣泛分布，國內外對它們的研究主要有化學成分分析、醫藥、獸藥、植物源殺蟲劑開發等［3-7］，近年來，關于這2種植物體外抑菌作用陸續有報道，但主要是其中某些化學成分，如黃酮、揮發油、鞣質、根及葉提取物或其與別的中草藥復方提取物等的抑菌研究［8-9］。本研究采用這2種植物全株的水煎煮液開展抑菌試驗，通過測定抑菌圈、最小抑菌濃度及溫度對抑菌效果的影響等來探討其抑菌效果，旨為拓寬水蓼、火炭母乃至蓼科植物的應用領域提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料水蓼、火炭母，均采自廣東省潮州市慧如公園，洗凈后80℃烘干備用。

1.1.2 供試菌種枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、青霉(Penicillium citrinum)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，由韓山師范學院微生物室提供。

1.1.3 培養基牛肉膏蛋白胨固體培養基和液體培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基。

1.1.4 試劑氯化鈉、鹽酸、蔗糖等均為分析純，購自廣州化學試劑廠;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物化學試劑，購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.5 儀器LDZX-50KB不銹鋼自動型壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;SW-CJ-IC型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;SPX-270型培養箱，寧波市科技園區新江南儀器有限公司;DGX-9243B-1鼓風干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司;PHS-3D PH計，上海雷磁等。

1.2 方法

1.2.1 水蓼、火炭母水煎煮液的制備稱取100 g水蓼，剪碎并研磨，加入500 mL蒸餾水，浸泡30 min，小火煮沸30 min，抽濾得濾液，藥渣再加500 mL蒸餾水，小火煮沸30 min，再次抽濾得濾液，合并2次濾液，然后小火加熱蒸發濃縮至100 mL，制成含生藥量為1 g/mL水蓼水煎煮液。將水蓼改成火炭母，制法同上，制得含生藥量為1 g/mL火炭母水煎煮液，將2種水煎煮液置4℃保存待用。

1.2.2 菌懸液的制備［10］將枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌3種供試細菌菌種分別接于牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，37℃恒溫培養24 h后，取1環接于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，置37℃恒溫培養24 h。進行平板菌落計數，根據計算結果用無菌生理鹽水將菌液調至約為106cfu/mL，4℃保存待用。將黑曲霉、青霉、釀酒酵母3種供試真菌菌種分別接于馬鈴薯蔗糖斜面培養基上活化，2種霉菌28℃培養72 h形成孢子后，用無菌生理鹽水把斜面上的孢子沖洗到滅菌試管中，酵母菌28℃培養48 h后用無菌生理鹽水將菌苔刮洗到滅菌的試管中，搖勻，然后用血球計數板進行計數。根據計數結果，用無菌生理鹽水將2種霉菌孢子液及酵母菌液調至約為106cfu/mL，4℃保存待用。

1.2.3 抑菌實驗①抑菌圈大小測定［11-12］:用無菌刻度吸管吸取1 mL供試細菌液置于無菌培養皿中，再倒入溶化并冷卻至50℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基約15 mL，輕輕轉動培養皿，使菌液與培養基混合均勻，冷凝制成平板。將含生藥量為1 g/mL的水蓼、火炭母水煎煮液分別用無菌水稀釋成濃度為0.8、0.6、0.4、0.2、0 g/mL(對照)的藥液。用無菌鑷子將直徑為6 mm的滅菌干燥濾紙片分別放入裝有各濃度藥液的培養皿中浸泡30 min，然后取出濾紙片，在培養皿內壁上濾去多余的藥液，將濾紙片貼入上述平板的表面，每皿貼3片，每菌每種濃度重復做3次，貼好濾紙片的平板在室溫下放置20 min后倒置于37℃恒溫培養24 h，取出測定抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。用無菌刻度吸管吸取1 mL供試真菌(孢子)液置于無菌培養皿中，再倒入溶化并冷卻至50℃左右的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基約15 mL，輕輕轉動培養皿，使菌液與培養基混合均勻，冷凝制成平板。按上面方法稀釋藥液、浸泡、粘貼濾紙片，將貼好濾紙片的平板在室溫下放置20 min后倒置于28℃恒溫培養48～72 h，取出測定抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果;②最小抑菌濃度(MIC)測定:采用試管2倍稀釋法測定MIC［12］。取10支滅菌試管，各管分別加入牛肉膏蛋白胨液體培養基1 mL，在第1管中加入1 mL滅菌的生藥量為1 g/mL植物水煎煮液，混勻后吸取1 mL加入到第2管中，依次類推，直至第8管，第8管吸取1 mL棄去，使其成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等濃度梯度。向1～8管中分別加入0.05 mL菌液，第9管不加植物水煎煮液，加菌液0.05 mL作為對照，以觀察細菌的生長情況。第10管加植物水煎煮液1 mL，混勻后，不加菌液，以觀察植物水煎煮液是否被污染。重復實驗3次，將各管置于37℃恒溫培養24 h，觀察結果。若藥液透明，可直接判定結果，若色澤較深，則用接種環挑取1環培養液于牛肉膏蛋白胨固體培養基上劃線培養18～24 h，觀察結果，以無菌生長的最低稀釋度為MIC;③溫度對抑菌效果影響測定:將生藥量為0.5 g/mL的2種植物水煎煮液經121℃高壓蒸汽滅菌處理后，采用①中所用的濾紙片法測定抑菌圈直徑，以確定高壓蒸汽滅菌對2種植物水煎煮液抑菌效果的影響。

1.2.4 數據分析所得數據采用SPSS 17.0軟件分別進行多重比較分析和t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈大小的測定結果

采用濾紙片法測定水蓼、火炭母水煎煮液的抑菌圈直徑，結果發現，這2種植物對黑曲霉、青霉、釀酒酵母均無抑制作用，它們對3種供試細菌的抑制作用結果見表1。

表1 水蓼、火炭母水煎煮液對供試細菌的抑菌圈直徑(單位:mm)Table 1 Diameter of inhibition zone of water extract from Polygonum hydropiper L.and Polygonum chinense L.on experiment bacteria(unit:mm)

由表1可知，水蓼、火炭母的水煎煮液在一定濃度范圍內(≤1.0 g/mL)，對3種供試細菌都有一定的抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑制作用，兩者隨著藥液濃度的增加而有顯著增強。當水蓼液濃度大于0.6 g/mL，火炭母液濃度大于0.2 g/mL時，兩者對3種供試細菌的抑菌效果均依次為金黃色葡萄球菌＞大腸埃希菌＞枯草芽胞桿菌。當藥液濃度相同時，對于同一種細菌的抑制作用，火炭母液要強于水蓼液。另外，當水煎煮液濃度較低(≤0.4 g/mL)時，水蓼液對枯草芽胞桿菌的抑制作用不明顯。由表1還可見，當水煎煮液濃度在1.0 g/mL時，火炭母對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌圈直徑分別達14.6 mm和11.2 mm，具有很好的抑菌效果，水蓼對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達11.0 mm，也具有很好的抑菌效果;當水煎煮液濃度在0.8 g/mL時，火炭母對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌圈直徑分別為13.4 mm和10.3 mm，仍具有很好的抑菌效果，水蓼對金黃色葡萄球菌也仍有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑達10.0 mm以上。

2.2 最小抑菌濃度的測定結果

在2.1中水蓼、火炭母水煎煮液對黑曲霉、青霉、釀酒酵母均無抑制作用，所以，只采用試管2倍稀釋法測定水蓼、火炭母水煎煮液對3種細菌的MIC，結果見表2。從表2可知，水蓼、火炭母水煎煮液對3種供試細菌的MIC大小均依次為金黃色葡萄球菌＜大腸埃希菌＜枯草芽胞桿菌，即2種植物水煎煮液對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，對大腸埃希菌抑制作用次之，對枯草芽胞桿菌抑制作用最弱。另外，對于同一種供試細菌而言，火炭母的MIC較水蓼的MIC小，即火炭母的抑菌效果強于水蓼，如表2中火炭母水煎煮液對金黃色葡萄球菌的MIC是1/64 g/mL、遠比水蓼水煎煮液對金黃色葡萄球菌的MIC 1/16 g/mL小。

表2 水蓼、火炭母水煎煮液對供試細菌的MICTable 2 MIC of water extract from Polygonum hydropiper L.and Polygonum chinense L.on experiment bacteria

2.3 溫度對抑菌效果影響的測定結果

水蓼、火炭母水煎煮液滅菌后對黑曲霉、青霉、釀酒酵母仍無抑制作用，這2種植物水煎煮液滅菌前后對供試細菌的抑菌圈直徑見表3。

表3 水蓼、火炭母水煎煮液滅菌前后對供試細菌的抑菌圈直徑(單位:mm)Table 3 Diameter of inhibition zone of water extract from Polygonum hydropiper L.and Polygonum chinense L.on experiment bacteria before and after sterilization(unit:mm)

表3結果表明，水蓼、火炭母水煎煮液中的抑菌物質熱穩定性較好，經121℃高壓蒸汽滅菌處理后，水蓼水煎煮液對金黃色葡萄球菌的抑制效果較滅菌前有極顯著增強，對大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的抑制效果較滅菌前稍有增強;火炭母水煎煮液對金黃色葡萄球菌的抑制效果較滅菌前稍有增強，對大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的抑制作用，滅菌前后變化不大。

3 討論

本實驗將水蓼、火炭母全株作為材料制備水煎煮液，探討它們對枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、青霉、釀酒酵母的抑制作用，發現這2種植物的水煎煮液在一定濃度范圍內對上述3種細菌均有不同程度的抑制作用，尤其對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌效果，而它們對上述3種真菌沒有抑制作用。2種植物的水煎煮液即使經高壓滅菌處理，對上述3種細菌的抑制作用仍未減弱，有的甚至有所增強，這可能是高壓滅菌時，藥液中具抑菌作用的鞣質等化學成分充分溶出或是高溫加熱過程中，不同成分間發生系列化學反應，生成了新的抗菌物質，而不同細菌對這類抗菌物質的耐性存在差異所致。

水蓼、火炭母在我國分布面積廣泛，資源豐富，若能以其為原料進行植物源抗菌劑的開發，可為食品、醫藥等行業做出一份貢獻，并將具有廣闊的前景和深遠的意義。

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