解脲脲原體生物膜藥敏檢測方法的研究進展

林飛燕，陸春*，葉庭路

(1.中山大學第三附屬醫院皮膚病與性病科，廣東廣州510630;2.北京大學深圳醫院皮膚病與性病科，廣東深圳518036)

解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum，Uu)為泌尿生殖道常見微生物，與許多泌尿生殖道疾病如非淋球菌尿道炎相關，也是男性不育、女性不孕及不良妊娠的常見病因之一。近年來隨著支原體耐藥情況、慢性持續性難治性感染的現象愈演愈烈，支原體感染的臨床治療效果面臨挑戰，關于Uu耐藥機制的探討已成為Uu研究的一大熱點。生物膜(Biofilm，BF)是微生物繁殖過程中將菌體包裹在自身產生的多糖、蛋白質和DNA等胞外基質中形成的團塊結構，多項研究表明生物膜的形成可以增強微生物對環境和抗生素的耐受性，目前生物膜的形成已被列入細菌耐藥尤其多重耐藥的機制之一［1］。國外已有研究證實Uu可以形成生物被膜，并且生物膜形成可同時增強Uu對大環內酯類、喹諾酮類、四環素等多種常用抗菌素的抵抗力［2］。對Uu生物膜的形成、耐藥性和耐藥機制的研究，為Uu臨床感染和抗生素耐藥機制提供了新的探索方向。既往Uu 的體外藥敏主要是針對游離菌株進行，并不能真實反映Uu體內生物膜形成和耐藥情況，因此，Uu生物膜的培養及藥敏檢測技術將繼游離支原體藥敏試驗之后，成為探討Uu耐藥水平與耐藥機制的又一重要手段。然而由于支原體生長的生物學特性，使培養基pH發生改變，而偏堿性環境下Uu會迅速死亡的生物學特性，使實驗中需要多次更換培養基并使菌液直接暴露，增加了污染的概率，培養過程中的雜菌污染由此成為決定Uu生物膜實驗成功與否的一大問題。本文將對解脲脲原體生物膜的培養與藥敏檢測技術進行介紹，列舉可疑污染的表現及分析思路，并對實驗操作過程中常見的污染途徑與相應的質控策略進行探討，希望能對今后國內生物膜相關的實驗研究起到借鑒作用。

1 Uu生物膜的培養與藥敏的方法

最小生物膜抑制濃度(Minimal Biofilm Inhibitory Concentration，MBIC)定義為陽性對照的微生物固定菌落剛開始使培養基變色時，某抗菌藥物能抑制其實驗菌培養基變色的最低濃度［2］。參考近幾年國內外文獻［2-3］，目前Uu生物被膜培養以及藥敏試驗均以尿素肉湯液體培養基為實驗載體，一般在CO2溫箱37℃培養48 h后進行藥敏檢測，具體方法如下:在96孔細胞培養板中加入Uu液體培養基180 μL/孔，再加入Uu菌液(CCU為104～105/mL)20 μL/孔，每24 h換液1次，48 h后棄去培養基，用滅菌PBS緩沖液200 μL/孔沖洗3次，棄去PBS緩沖液，再逐孔加入含不同濃度梯度的抗生素培養基200 μL/孔，滴加石蠟油1～2滴/孔，觀察48 h直至陽性不加藥對照孔培養基變紅色時記錄生物被膜的最低抑菌濃度即MBIC。

實驗過程中發現，在保證培養基pH為6.0、菌液濃度單位為104～105/mL的實驗條件下，液體培養基多在第24 h前后開始變為紅色即提示Uu菌株生長，而在更換培養基之后，常未足48 h培養基即已變為深紅色。此后若在第48 h再予以更換培養基，則會出現支原體無生長(培養基不再變為紅色)或生長受抑制(培養基變紅時間明顯延遲)。可能是由于Uu的生長分為遲緩期、對數生長期、穩定器和遲緩期，在恢復生長之后首先是緩慢增殖，經歷遲緩期后進入對數生長期而開始迅速增殖［4］。在環境穩定、營養充足的情況下，Uu后24 h的生長速度必然會快于前24 h，因而在48 h之前就會出現Uu過渡生長、大量分解尿素產氨堿化培養基，從而在過堿性的環境中迅速死亡或抑制生長。經重復實驗發現，如果在第36 h時更換培養基，則不會出現明顯的生長抑制的情況，同時可以維持Uu生長環境的穩定以及提供充足的營養，有利于Uu正常增殖。但是，更換培養基的次數增多無疑又增加了實驗污染的風險。

2 Uu培養中的常見污染及分析

臨床中判斷Uu的生長狀況主要根據肉眼觀察培養基的顏色變化，其原理是根據Uu分解培養基中的尿素產堿使pH上升，而酚紅指示劑在由酸變堿時顏色會由黃變紅，如果培養基變為紅色且液體澄清判讀為Uu陽性，不變色且澄清則為陰性無污染。但是能分解尿素的微生物很多，已知脲酶陽性的有部分金黃色葡萄球菌及腸桿菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、新型隱球菌等等，這些雜菌的生長不僅會出現培養基渾濁，也會使培養基變紅，從而影響對Uu生長的正確判斷。

各種污染可能情況分析如下:①如果培養基不變紅色而出現渾濁，常為不產脲酶的污染菌所污染且Uu為陰性，但是需注意由于有細菌生長競爭，會消耗培養液的營養成分，不排除不產脲酶細菌的濃度過高而抑制支原體生長出現假陰性;②理論上講，只要待檢標本中存在的脲酶陽性細菌，都有可能使培養基變紅，但其結果還與細菌濃度有關。低濃度細菌(102～103/mL)的Uu培養管中液體仍清亮，呈黃色，無明顯混濁，高濃度細菌(104～105/mL)的Uu培養管中液體呈紅色，不同程度混濁［5］。同時出現紅色與渾濁的培養基中，既可能為Uu陽性合并污染，也可能為產脲酶菌污染以及伴或不伴Uu生長，臨床檢驗一般會判斷陰性，但如果其中同時有Uu生長就會造成假陰性的判斷［6］;③某些細菌在使Uu培養基變紅的同時，培養基會出現異臭味，如變形桿菌、銅綠假單胞菌等則可直接排除［5］;④對于以上各種可疑的污染，實驗中通常將污染結果剔除，也因此會由于重復操作而增加了實驗成本。但有些污染的標本外觀和Uu真陽性無法區別，這更值得注意，這種情況下需要增加質控項目，除應用孔徑為0.45 μm的無菌濾膜過濾并進行Uu鑒別固體培養基培養鑒定外，還應在實驗過程中對菌液與培養基隨機取樣，進行細菌分離及脲酶實驗，出現分解尿素的細菌即判為污染。

總體而言，支原體培養基中污染菌的種類繁多、尚無簡便易行的分離與鑒定方法，另外實驗過程中各種污染途徑尚具有偶然性與不可預測性，故多數不以污染菌為研究目的的支原體培養實驗，例如支原體生物膜的培養與藥敏試驗，通常沒有足夠的條件、亦不可能對所有可疑的污染菌進行分離與鑒定。因此，監控實驗污染最直接而有效的策略是規范無菌操作、嚴格控制高污染風險的操作環節、細致觀察培養基、徹底剔除被污染的實驗結果。

3 Uu生物膜培養與藥敏試驗中的污染途徑及解決策略

由于支原體生長的生物學特性，使培養基pH發生改變，而偏堿性環境下Uu會迅速死亡的生物學特性，使實驗中需要多次更換培養基并使菌液直接暴露，增加了污染的概率，培養過程中的雜菌污染由此成為決定Uu生物膜實驗成功與否的一大關鍵問題。下文列舉了實際操作過程中常見的污染途徑與相應的質控策略，希望能對今后國內生物膜相關的實驗研究起到借鑒作用。

3.1 Uu菌液的準備與保存

3.1.1 菌液準備實驗所用的臨床支原體菌株必須經過嚴格的培養、分離、鑒定過程:經微孔濾器過濾預處理雜菌，肉湯增菌觀察顏色變化，將變紅的增菌培養液轉瓊脂固體培養基，觀察其典型菌落形成，依據菌落形態和有關生化、分子生物學技術進行鑒定，挑取單個的典型菌落轉種至液體培養基，-72℃超低溫冰箱冷凍保存［4］。

3.1.2 菌液存取即使擁有合格無污染的待測菌液，在菌液轉移保存、菌液濃度測定、稀釋菌液至實驗濃度等環節中，也可能由于無菌操作的失誤導致污染。例如，通常用1.5 mL EP管保存菌液，由于水凝固后體積增加，如保存菌液量過大(大于1.3 mL/管)則結冰后易膨脹甚至頂開EP管蓋而導致污染，此時應將受污染的菌液棄去，再次取材重復操作。此外，實驗早期就應做好純化菌株的備份，并嚴格保證凍存菌液無污染，以及避免對備份菌液重復打開操作，以減少污染后的反復分離、鑒定。

3.2 Uu肉湯液體培養基及抗生素-培養基

3.2.1 培養基的配制各種原料應無菌處理后方可加入培養基，水質選擇消毒無菌的雙蒸水或超純水，實驗器材經泡酸及高溫高壓消毒，培養基配制完成后及使用過程中，應不定期取樣置于溫箱行無菌培養以排除污染。

3.2.2 培養基抑菌劑的選擇目前Uu培養基一般添加的抗菌劑為青霉素類，青霉素類對大多數革蘭陽性球菌的作用較強，但對陰性桿菌(常見變形桿菌)、真菌(常見白色念珠菌)無抑制作用，由此存在此類雜菌污染的風險。關于Uu培養基中抑陰性桿菌抗菌劑的選擇，有研究［7］指出亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦對支原體無抑制作用，可用于抑制肉湯培養基中的陰性桿菌。氟康唑可以抑制常見的真菌污染如白色念珠菌，也不會抑制Uu生長，同時各種理化性質較穩定以及MIC較低，賈亞利等［8］研究認為31.25 μg/mL的氟康唑可以作為Uu培養基中真菌抑菌劑的首選。

3.2.3 更換培養基的操作①瓶裝培養基:必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼，傾倒培養基時瓶口應凌空倒出，不宜直接接觸吸槽或其他瓶口等，倒出后應再轉動燒灼瓶口與瓶蓋再蓋上;②移液槍:使用多道移液槍添加或更換培養基時，培養基常置于吸槽，會直接暴露于空氣中，易被空氣懸浮顆粒污染，故吸槽應置于酒精燈旁的清潔區，同時操作動作要輕柔，尤其在打出移液槍中的棄液時，廢液缸應遠離吸槽，移液槍槍口不宜對著吸槽方向。另外，一般8孔移液槍相配套的200 μL槍頭，在反復吸取培養基時，會在槍頭內液體頂端出現氣泡，并直接接觸到移液槍受到污染，建議將每次的取液量減少1/2，即200 μL/孔的培養基量，改用100 μL/次的添加量操作2次，這樣可以減少來自移液槍的污染。

3.2.4 設定陰性對照孔每次添加或更換培養基時，必須設立培養基的陰性對照孔，即只在孔中加入200 μL/孔的培養基及滴加石蠟油。同時需注意，由于可能在操作過程中造成污染，故每次添加培養基需設定2個空白孔，其一是操作前的培養基，其二是操作后的培養基，這樣如果2孔均被污染提示吸槽或槍頭消毒不徹底，或瓶裝培養基污染，這時需再次檢測培養基，以及消毒吸槽與槍頭;如果僅第2孔出現污染，則提示培養基等無污染，污染來自操作過程，故應重復該次操作。

3.2.5 抗生素-培養基稱取抗生素藥粉，溶解稀釋后應經微孔濾器預處理再用培養基稀釋。稀釋至目標濃度后，每個濃度的抗生素-培養基均需行無菌培養排除污染后方可使用，每一批操作向96孔板加入抗生素后，均應重復抗生素-培養基的無菌檢測，如有污染則重新稀釋配置。

3.3 操作環境與實驗器材

3.3.1 生物安全柜的使用遵守生物安全柜操作說明，實驗前清臺面及內壁，紫外線照射30 min，將實驗用器具外表面用75%乙醇噴淋或擦拭后放入生物安全柜，將循環過濾系統開啟后方可開始實驗操作。實驗后應清潔臺面及內壁，關閉循環過濾系統，紫外線照射30 min后方可關閉生物安全柜電源。超凈工作臺不合理的放置、不恰當的維護以及不規范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向，導致飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導致超凈工作臺內物品污染的主要因素，造成潛在污染的進一步傳播［9］。

3.3.2 實驗器材玻璃制品實驗器材應洗刷干凈，在濃酸溶液中浸泡過夜后反復清水沖洗，徹底去除酸液，合理包裝并高溫高壓消毒30 min及烘干后方可使用。實驗器材為一次性塑料制品如96孔細胞培養板，應購買合格、無菌、獨立包裝的產品，使用前檢查產品包裝密封性。EP管、槍頭等一次性塑料用品，以及塑料吸槽等，應該用相應盒子包裝、高溫高壓消毒30 min后方可使用，并且不宜多次實驗反復使用，以更換培養基為例，每批更換后都應將此類器材重復清潔消毒。

3.4 石蠟油

3.4.1 石蠟油污染石蠟油會直接造成污染導致前功盡棄，應使用滅菌的石蠟油。

3.4.2 滴加石蠟油在往藥敏板接種滴加石蠟油時，原先正放的石蠟油瓶會因倒置會混有空氣，使下注后含有小氣泡，當張力造成氣泡破裂后，不能全部復蓋住其下的接種液面，使培養基暴露而導致污染。同時，氣泡破裂后，還會因為Uu生長產生的氨揮發而使pH值下降，藥敏孔由紅色再次變為黃色，出現假陰性結果或高-低藥物濃度孔結果倒置。解決方法是在混有小氣泡的孔中再補加1滴石蠟油，確保藥敏孔被完全覆蓋［10］。

4 展望

綜上所述，生物膜體外藥敏試驗方法的建立和穩定性的探索，為Uu耐藥機制的探討提供了新的有力手段。隨著生物膜培養和藥敏方法的推廣，樣本量和實驗規模不斷擴大，實驗室培養的污染概率也會隨之增高。生物膜體外培養過程中存在多種潛在的污染途徑，因而對雜菌污染的有效預防和監控，是Uu生物膜實驗中必須要解決的一個重要問題。提高對Uu生物膜培養和藥敏檢測各環節中污染途徑的重視，進行細節上的嚴格控制和改進，降低雜菌污染對生物膜實驗的干擾和危害，對生物膜的研究具有重要的意義。

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