變構菌素生物合成基因簇的研究進展

李明，唐莉

(大連理工大學分子藥物中心，遼寧大連116024)

1989年，Cheng及其同事從中國浙江省的土壤樣品中分離出鏈霉菌Streptomyces griseochromogenes，在其發酵液中提取出一種具有抗真菌活性的化合物，命名為Tautomycetin(TTN)［1］，變構菌素。它是一種互變異構混合物，呈酸性的黃色膠狀固體，具有旋光性，［α］20D+19.4°(C=0.83，CHCl3)，溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和苯，難溶于水和正己烷。UV λmax=268 nm，在298 nm有一個肩峰。通過化學降解和光譜分析等方法，Cheng等［2］進一步確定了TTN的結構，其化學式為C33H50O10，相對分子量606.75，由左側的二烷基馬來酸酐和右側的線性聚酮側鏈組成，屬于Ⅰ型聚酮化合物。TTN的結構與變構霉素Tautomycin(TTM)高度相似(圖1)［3］，兩者都是有效的細胞可滲透性蛋白磷酸酶PP1/PP2A抑制劑［4-5］。PP1和PP2A是主要的絲-蘇氨酸蛋白磷酸酶，參與眾多生理活動:如細胞內糖代謝、鈣轉運、肌肉收縮、基因表達、蛋白質合成、細胞凋亡等［3，6-7］。許多癌癥都是由蛋白磷酸酶的異變所引起的，因此對PP1和PP2A的選擇性抑制被認為是篩選抗腫瘤藥物的標準。TTM對PP1和PP2A的IC50為22～32 nmol/L，對兩者的選擇性相對接近。而TTN對PP1和PP2A的IC50分別為1.6 nmol/L和62 nmol/L，相差約40倍，顯示出對PP1的超高選擇性。這一高選擇性也使TTN成為研究PP1在多個生物途徑中所起作用的較好工具。TTN和TTM在結構上的區別為:TTM側鏈上有螺酮縮醇，而TTN上的相同部位缺少這一結構;此外，TTN末端C1-C5的雙鍵結構也不同于TTM。這些不同點可能是決定TTN對PP1更具特異性的原因。TTN還被證實在器官移植中對T細胞具有免疫抑制的作用［8-9］。TTN抑制T細胞擴散的濃度比cyclosporine A(CsA)的有效抑制濃度低100倍。CsA和FK506都是通過與親免素相結合來達到他們的藥物作用的。這一結合體又與Ser/Thr鈣調神經磷酸酶相結合幷抑制其活性。但是因為鈣調神經磷酸酶的生理普遍性使得這一作用有一些負面影響［10-12］。而TTN的免疫抑制作用完全不同于CsA和FK506，它通過酪氨酸磷酸化來阻斷T細胞內Src酪氨酸磷酸激酶下游的信號介質，而這一阻斷導致Bcl-2、caspase-9、caspase-3和poly(ADP-ribose)polymerase(但不是caspase-1)的斷裂，從而造成特異性細胞凋亡［13］。對活性T細胞的特異性抑制使這一獨特的聚酮化合物優于CsA和FK506，成為免疫抑制藥物的開發首選。

圖1 TTN和TTM的結構［3］Fig.1 Chemical structure of TTN and TTM［3］

1 TTN生物合成基因簇的研究

韓國仁和大學的Choi等［14］在2007年率先報道了約70 kb的TTN生物合成基因簇的分離和鑒定。而美國威斯康星大學麥迪遜分校的Shen研究小組隨后在2009年發表了全部TTN生物合成基因簇的分離，并通過基因失活和互補實驗證實了部分參與TTN生物合成基因的功能［15］。TTN基因簇定位于一個79 kb大小的DNA區域，由19個開放閱讀框(ORF)構成，這些閱讀框編碼的蛋白包括2個聚酮合成酶Ⅰ(PKSⅠ)(TtnAB)、1個硫酯酶Ⅱ(TtnH)、8個參與合成二烷基馬來酸酐的酶(TtnKLMNOPRS)、4個后修飾酶(TtnCDFI)、還有2個調控蛋白(TtnG和TtnQ)和1個抗性蛋白(TtnJ)。

1.1 聚酮鏈合成相關基因

在TTN基因簇中編碼兩個PKSⅠ的開放閱讀框ttnA和ttnB具有相同的轉錄方向，兩者相加共有10個PKS模塊:ttnA編碼一個裝載模塊和延伸模塊1-5，ttnB編碼延伸模塊6-9和一個卸載聚酮鏈的C端硫酯酶。所有模塊都具有高度保守的序列。這些模塊中有很多不同的功能結構域，包括10個酮基酰基-ACP合成酶(KS)、7個脫水酶(DH)、10個酰基轉移酶(AT)、3個烯醇還原酶(ER)、10個酰基載體蛋白(ACP)和一個硫酯酶(TE)。這些結構域上的活性位點都十分保守，例如:所有的KS結構域上都包含縮合反應所需的CHH催化三聯體，所有的ACP結構域都包含有高度保守的DSL活性位點。而ttnB上的最后一個活性結構域TE，包含非常保守的GXGSXG和GdH位點，已被證實在β-羥基位置具有高度立體選擇性［16］，其功能是卸載聚酮鏈。為了進一步證實通過序列比較所推斷出的基因功能，Shen小組利用PCR targeting的方法將ttnA失活，所得突變體經發酵和高壓液相色譜分析，結果顯示ttnA的破壞徹底影響了TTN的生物合成。

1.2 二烷基馬來酸酐合成相關基因

TTN生物合成基因簇中的ttnKLMNOPRS 8個基因與TTM基因簇中參與二烷基馬來酸酐合成的ttmKLMNOPRS具有高度同源性，雖然它們在各自基因簇中的位置和排列順序有所不同，但ttnKLMNOPRS編碼的基因產物很有可能參與二烷基馬來酸酐的合成。這8個基因產物包括:(i)TtnO，檸檬酰輔酶A裂解酶;(ii)TtnP，輔酶A轉移酶;(iii)TtnR，脫水酶;(iv)TtnM，羥化酶;(v)TtnK，酯酶;(vi)TtnS，環化酶;(vii)TtnL，磷脂酰乙醇胺結合蛋白;(viii)TtnN，未知功能蛋白。為了證明它們的功能，Shen等［15］對其中的ttnM、ttnP、ttnR和ttnS進行了基因敲除和互補實驗，對所得突變菌株發酵后的TTN產量進行了分析。所有4個基因的破壞都完全阻止了TTN生物合成，顯示了這4個基因在TMC生物合成中的重要性。此外，在ttnP、ttnR和ttnS的突變菌株中沒有檢測到任何中間產物，證明了它們在二烷基馬來酸酐合成中的重要作用。而ttnM敲除菌株的發酵液中分離出以TTN M-1(C-3'脫羧形式的TTN)為主的4種代謝產物，也證明了TtnM在C-3'位置的羥化作用。

1.3 聚酮鏈后修飾基因

相對于由TtnB中硫酯酶卸載下來的新生聚酮鏈，TTN結構中的聚酮鏈與其有2點不同:(i)C-5位置的羰基，(ii)末端雙鍵結構。Ttn基因簇中有4個基因的產物可能參與對聚酮鏈的后修飾作用，包括TtnC、黃素蛋白脫羧酶;TtnD、UbiD家族脫羧酶;TtnF、L-肉堿脫水酶;TtnI、細胞色素P450羥化酶。根據基因功能推斷，聚酮鏈末端脫羧和脫水形成烯烴結構的反應可能由TtnD和TtnF所催化。對ttnD和ttnF的基因失活和互補實驗證實了這一判斷［17］。ΔttnF產生了TTN-F1，如圖2所示，而ΔttnD產生了TTN-D1(4)、TTN-D2(5)、TTN-D3(6)和TTN-D4(7)。TTN-F1的結構確認了TtnF作為脫水酶的功能。另外，其末端的酸基說明TtnD的脫羧作用應該依賴TtnF的存在，TtnD自己不能有效地進行脫羧。ΔttnF的發酵液中未分離到TTN和產物4、5、6、7，說明TtnF和TtnD的作用可能是共同的。所有的突變菌株都未產生含有β-羥酸的中間產物，說明C5位的氧化作用可能在TtnD和TtnF之后進行，這一步驟可能由TtnI，細胞色素P450羥化酶的同系物，也是ttn基因簇中唯一一個加氧酶所催化。實驗表明產物3、4、6、7對PP1的抑制濃度低于TTN約一個數量級，而對PP2A的抑制能力與TTN相當，說明TtnD和TtnF對右半部分結構的修飾大大加強了TTN對PP1的選擇性。

圖2 ΔttnF和ΔttnD突變菌株中的TTN合成中間產物和副產物［17］Fig.2 TTN biosynthetic intermediates and shunt metabolites accumulated in the ΔttnF and ΔttnD mutant strains［17］

1.4 調控基因和抗性基因

對ttn基因簇的測序結果也顯示了調控基因和抗性基因的存在。2個調節基因分別是ttnG，編碼一個與ThcG具有33%同源性的蛋白，ThcG是Rhodococcus erythropolis中的一個調控蛋白;ttnQ編碼一個與SareDRAFT_1231具有41%同源性的蛋白，SareDRAFT_1231來源于Salinispora arenicola CNS205。這2個蛋白都屬于LuxR家族的轉錄因子，在它們的近C端具有典型的LuxR螺旋-轉角-螺旋基序(HTH motif)。LuxR家族的蛋白通過與DNA結合而激活，同時與autoinducers如N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone有關。但是分析結果顯示TtnG和TtnQ都缺少N端autoinducer結合區域。此外，TtnG蛋白上有TTA密碼子，這說明它的轉錄可能依賴tRNA UUA構成基因bldA。對ttnQ和tmcN(ttnG同源基因)的基因破壞完全阻止了TTN的生物合成［15，18］，說明了這2個蛋白作為正調控因子的重要作用。通常微生物自身都具有用來自我保護的抗性機制，包括胞內物質修飾或儲存，以及向細胞外的傳輸等。在ttn基因簇中也發現了一個傳輸蛋白，TtnJ。TtnJ與Rhodococcus sp.RHA1中的細胞質膜多抗性傳輸蛋白RHA1_ro04399(YP_704343)具有49%的同源性［15］。因此可判斷出S.griseochromogenes的抗TTN機制是通過傳輸機制實現的。

2 TTN生物合成途徑的推斷

根據從序列分析得出的功能分配和基因失活及互補實驗結果，研究人員已初步推斷出了TTN的生物合成途徑，如圖3所示。TTN的聚酮側鏈由TtnA和TtnB催化合成。它們共同催化了9個脫羧縮合反應，其中利用1個乙酰輔酶A(acetyl-CoA)作為起始單元，3個丙二酸單酰輔酶A(malonyl CoA)，4個甲基丙二酰輔酶A(methyl malonyl-CoA)和1個乙基丙二酰輔酶A(ethyl malonyl CoA)作為延伸單元。2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)和丙酸(propionate)在TtnLMNOPRS的催化下合成了二烷基馬來酸酐，再通過TtnK將其和聚酮鏈的一部分酯化偶聯，所得中間產物經硫酯酶卸載后進一步通過TtnDFI修飾得到TTN。這一合成途徑中有3個關鍵步驟尚未確定，分別是:(i)二烷基馬來酸酐與部分聚酮鏈酯化偶聯的時間;(ii)C-5位的氧化;(iii)末端雙鍵的形成。在之前對相似天然產物TTM的研究中，Li等［19］發現二烷基馬來酸酐是合成之后與聚酮鏈發生的酯化偶聯，而不是與一段聚酮鏈偶聯后不斷延伸加長的。但TTN的情況不同，對編碼二烷基馬來酸酐的基因ttnP、ttnR和ttnS進行基因失活后，發酵不能得到TTN，同時也沒有合成聚酮鏈結構或相關代謝產物，說明二烷基馬來酸酐可能在聚酮鏈完全合成并卸載之前與之偶聯，但具體的連接時間還尚未研究清楚。而C-5位置氧化和末端雙鍵的形成可能有以下2種途徑:(i)聚酮鏈從TtnB上卸載之后，所得中間產物3先經TtnF催化脫水形成雙鍵，再由TtnI在C-5位氧化生成酮基，最后由TtnD脫羧生成TTN。(ii)中間產物3在TtnF和TtnD同時作用下產生一個具有末端雙鍵結構的中間產物，這一產物的C-5位置再經TtnI氧化生成TTN。

圖3 TTN的生物合成途徑推斷［15，17］Fig.3 Proposed biosynthesis pathway of TTN［15，17］

3 展望

TTN對蛋白磷酸酶PP1的抑制有著高選擇性，而對活性T細胞的特異性抑制也優于其他免疫抑制劑，因此，TTN及其衍生物在腫瘤治療、免疫抑制等諸多領域都有著廣泛的應用前景。TTN

生物合成基因簇的分離和生物合成途徑的研究可為TTN及其衍生物的工業化生產和新藥研發奠定良好基礎。目前為止，TTN生物合成途徑雖已基本闡明，但其中部分基因的功能和關鍵步驟還尚未確立，如二烷基馬來酸酐的生物合成相關基因，聚酮鏈與二烷基馬來酸酐的結合時機等。本研究小組正在開展對這些方面的研究，目前已對二烷基馬來酸酐合成相關基因如ttnN等進行了基因失活、異源表達等研究，為進一步確立TTN的生物合成途徑及活性衍生物的開發奠定了基礎。

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