MTT法檢測細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的主要影響因素分析

吳窈畫，談書華，范超超，李正華

(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司暨南通市微生物學(xué)醫(yī)療器械工程技術(shù)中心，江蘇海門226100)

1983年，Mosmann報(bào)告活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶將MTT(四甲基偶氮唑鹽，淡黃色)還原形成甲臜(Formazan，藍(lán)紫色)的量與活細(xì)胞數(shù)成正比的活細(xì)胞分析方法，即MTT法［1］。該方法因具有敏感、快速和便捷的特點(diǎn)而被廣泛用于生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模篩選抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性測定［2-5］，以及微生物活菌計(jì)數(shù)［6-7］。微生物學(xué)用于細(xì)菌計(jì)數(shù)的常規(guī)方法有比濁法、分光光度計(jì)法和平板菌落計(jì)數(shù)法等［8］。前2種方法操作簡單，只適于測定細(xì)菌總量。平板菌落計(jì)數(shù)法可檢測活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)，但方法繁瑣、重復(fù)性差和檢測周期較長。已經(jīng)有一些將MTT法應(yīng)用于細(xì)菌活細(xì)胞計(jì)數(shù)的報(bào)告，但是，缺乏對實(shí)施該方法的影響因素的系統(tǒng)研究。本課題對與MTT法定量檢測4種病原細(xì)菌活細(xì)胞數(shù)有關(guān)的分析前培養(yǎng)時(shí)間、MTT還原反應(yīng)時(shí)間、MTT量和針對反應(yīng)產(chǎn)物的最適檢測波長等進(jìn)行了研究。同時(shí)發(fā)現(xiàn)經(jīng)溶解和直接檢測細(xì)胞內(nèi)Formazan可以獲得一致的分析結(jié)果。此外，應(yīng)用本研究獲得的各個實(shí)驗(yàn)參數(shù)建立的MTT法可以獲得與平板菌落計(jì)數(shù)法一致的檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株由ATCC引進(jìn)的實(shí)驗(yàn)菌株包括大腸埃希菌(Escherichia coli，ATCC 25922)、銅綠假單胞(Pseudomonas aeruginosa，ATCC BAA-427)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，ATCC 6305)和脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis，ATCC 25285)，分別代表需氧、兼性厭氧和厭氧細(xì)菌。

1.1.2 稀釋液和培養(yǎng)基0.90%NaCl(pH 7.2)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA，含或不含5%羊血)、腦心浸液液體培養(yǎng)基(BHI)和腦心浸液瓊脂(BHIA，含5%羊血)。

1.1.3 主要試劑5 mg/mL MTT溶液［6］(取100 mg MTT溶于20 mL pH 7.4的0.01 mol/L PBS緩沖液中，充分溶解后過濾除菌，4℃避光保存)、三聯(lián)溶解液［9］(SDS 10 g，異丁醇5 mL，10 mol/L HCl 0.1 mL，用雙蒸水配成100 mL溶液)。

1.2 方法

1.2.1 分析前培養(yǎng)時(shí)間測定將-70℃保存的E.coli菌種接種到TSA上37℃過夜培養(yǎng)。挑取平板上生長良好的單菌落接種到TSB中，37℃靜止培養(yǎng)18～24 h。按1%接種量轉(zhuǎn)接入50 mL新鮮的TSB中，37℃靜止培養(yǎng)48 h，間隔一定時(shí)間取樣1次。取測試樣品100 μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(重復(fù)3孔)，分別加入MTT溶液至終濃度0.5 mg/mL。同時(shí)設(shè)置空白對照，混勻后置于37℃，30 min后取出培養(yǎng)板，加入三聯(lián)溶解液100 μL，充分溶解后測定OD578值［9］。對同一份樣品同時(shí)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)法測定［8］:對測試樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取各梯度菌液分別做活菌平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.2.2 還原反應(yīng)時(shí)間和MTT劑量分析取4種病原菌對數(shù)生長期的純培養(yǎng)物(各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件［10］如表1)，于適量0.90%NaCl中分別制成約3.0×109cfu/mL細(xì)菌懸液，連續(xù)3倍梯度稀釋獲6種濃度。取各濃度菌液100 μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組9個平行，均分3組，分別加入MTT溶液至終濃度0.25、0.5和0.75 mg/mL。混勻后于合適條件下培養(yǎng)，間隔30、60、120、180、240、300 min取出培養(yǎng)板，加入100 μL三聯(lián)溶解液充分溶解后測定OD578值。

表1 各標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)條件Table 1 Incubation conditions for different ATCC strains

1.2.3 最適檢測波長測定按1.2.2制備4種菌株的細(xì)菌懸液(約1.5×108cfu/mL)，分別取100 μL于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(重復(fù)6孔)，加樣孔中分別加入MTT溶液至終濃度0.25 mg/mL。同時(shí)設(shè)置空白對照，混勻后置于37℃，2 h后取出培養(yǎng)板，再加入三聯(lián)溶解液100 μL。充分溶解后，依次測定530～630 nm的OD值。以測定波長為橫坐標(biāo)，相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長。

1.2.4 溶解和直接檢測細(xì)胞內(nèi)Formazan比較

按1.2.2制備E.coli細(xì)菌懸液(約3.0×109cfu/mL)，取制備好的菌懸液50、100、200、300和400 μL，分別補(bǔ)稀釋液至1 mL，振蕩混勻。按1.2.3加樣，重復(fù)2塊細(xì)胞培養(yǎng)板。MTT反應(yīng)結(jié)束后，一塊板孔中分別加入三聯(lián)溶解液100 μL，充分溶解后測定OD578值;另一塊于微型振蕩器上充分振蕩15 min后測定OD578值。

1.2.5 MTT法與平板菌落計(jì)數(shù)法比較按1.2.2制備4種菌株的細(xì)菌懸液(約1.5×108～3.0×109cfu/mL)，連續(xù)3倍梯度稀釋獲6種濃度。按1.2.4中直接檢測法測定各濃度的OD578值，同一組分同時(shí)做活菌平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法分析前培養(yǎng)時(shí)間檢測

在細(xì)菌生長的各個階段，MTT法與平板活菌計(jì)數(shù)法檢測結(jié)果均表現(xiàn)出達(dá)到最大值后出現(xiàn)下降(圖1)。

圖1 2種不同方法測定E.coli的生長曲線Fig.1 The cell growth curve of E.coli measured by two different methods

2.2 還原反應(yīng)時(shí)間對測定結(jié)果的影響

MTT=0.5 mg/mL時(shí)，在反應(yīng)初期，肉眼可以觀察到高濃度菌液即出現(xiàn)均勻的藍(lán)紫色。反應(yīng)30 min后，各濃度菌液的OD578已有明顯梯度變化(圖2)。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，OD578逐漸增加，2 h后變化趨緩，4～5 h后基本平穩(wěn)(圖3)。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對測定結(jié)果的影響Fig.2 Effects of reaction time on the measuring results

圖3 不同菌株測定結(jié)果隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況Fig.3 Changes of the measuring results of different strains with reaction time

2.3 MTT量對測定結(jié)果的影響

圖4 MTT量對測定結(jié)果的影響Fig.4 Effects of the MTT concentration on the measuring results

在相同濃度的活菌液中分別加入終濃度為0.25、0.5和0.75 mg/mL的MTT溶液，2 h后各濃度菌液OD578測定結(jié)果如圖4所示。MTT=0.25 mg/mL時(shí)，對4種細(xì)菌均具有較好的線性關(guān)系(r=0.999 8)。

2.4 最適檢測波長分析

4種細(xì)菌形成的Formazan在530～630 nm范圍內(nèi)的最大吸收峰均在560～580 nm處(圖5)。

2.5 溶解和直接檢測細(xì)胞內(nèi)Formazan的比較

肉眼觀察，在反應(yīng)初期反應(yīng)體系為均一的藍(lán)紫色，靜止一段時(shí)間后出現(xiàn)大量顆粒物聚集，經(jīng)振蕩后又重新分散均勻。顯微鏡下觀察，菌體呈淡藍(lán)色，內(nèi)部有深藍(lán)紫色圓形顆粒，加裂解液后菌體形態(tài)不清晰、藍(lán)紫色顆粒變淡(圖6)。對E.coli細(xì)胞形成的Formazan，分別采用直接檢測與溶解后檢測，結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)無顯著性差異(P＞0.05)(表2)。

圖5 細(xì)菌菌體形成的Formazan光密度值隨波長變化情況Fig.5 The variation of OD values of formazan with the wavelength

圖6 MTT反應(yīng)后的E.coli細(xì)胞(1 000×)Fig.6 Cells of E.coli after interaction with MTT(1 000×)

表2 MTT溶解與直接檢測比較Table 2 Comparison between the dissolution and the direct test

2.6 MTT法檢測的光密度值與平板活菌計(jì)數(shù)的比較

E.coli、P.aerugonisa、S.pneumonia和B.fragilis 4種病原菌菌濃度分別在2.13×107～1.60×109、1.33×107～5.67×108、1.00×106～1.17×108和2.40×107～3.67×109cfu/mL范圍內(nèi)時(shí)，MTT法檢測的OD578與平板計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)之間均具有較好的線性關(guān)系(r≥0.991 7，P＜0.05)(圖7)。

圖7 MTT法與平板菌落計(jì)數(shù)法的線性關(guān)系Fig.7 The liner relationship between the MTT assay and the plate colony counting method

3 討論

本研究對MTT法用于定量分析細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的主要影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。基于4種細(xì)菌的代時(shí)相近，試驗(yàn)中以E.coli為代表菌對MTT分析前的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了研究。測試結(jié)果顯示Formazan生成量與細(xì)菌活細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，對數(shù)生長期變化最為明顯。細(xì)菌處于對數(shù)生長期和穩(wěn)定期對MTT法的測定結(jié)果影響不大［6］，因此實(shí)驗(yàn)中均采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行研究。

本研究拓展了MTT法在原核細(xì)胞型微生物尤其是兼性厭氧和厭氧菌檢測方面的應(yīng)用。測試結(jié)果顯示:4種細(xì)菌在其最適培養(yǎng)條件下均可還原MTT生成Formazan，表明微生物細(xì)胞利用MTT的現(xiàn)象具有普遍性。通過對還原反應(yīng)時(shí)間、MTT量和最適檢測波長的分析，獲得了MTT法測定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的最佳條件:Formazan最大吸收波長為570～580 nm，MTT終濃度為0.25 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為2 h。Formazan的生成量反映了細(xì)胞還原MTT能力的大小，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):不同微生物的相同細(xì)胞濃度對應(yīng)的吸光值有區(qū)別，具體表現(xiàn)為其回歸直線的斜率不同，說明不同微生物細(xì)胞還原MTT的能力存在差異。

MTT經(jīng)還原生成的Formazan不溶于水，通常需要有機(jī)溶劑(如二甲基亞砜、異丁醇等)溶解后才能檢測［4-7，9］。這不僅使工作量增加，也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且使用的有機(jī)溶劑對人體也有損害。本研究通過定性和定量的分析方法，驗(yàn)證了細(xì)菌形成的Formazan可以不使用裂解液。推測可能是微生物細(xì)胞與動物細(xì)胞在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和體外培養(yǎng)特點(diǎn)上的差異引起的:醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的動物細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等大多數(shù)真核細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)需要附著在固相表面才能生長;與真核細(xì)胞相比，微生物細(xì)胞個體微小、具有細(xì)胞壁、能耐受攪拌，容易懸浮形成均一的介質(zhì)。

在以上研究基礎(chǔ)上建立的MTT法，定量檢測細(xì)菌細(xì)胞數(shù)濃度在107～109cfu/mL的測試結(jié)果與平板活菌計(jì)數(shù)具有較好的線性關(guān)系。因此，MTT法可以用于大部分細(xì)菌的活菌測定，簡化操作過程的同時(shí)滿足大批量樣本的處理需求。

［1］ Mosmann T.Rapid colorimetric assay cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.

［2］ Berridge MV，Herst PM，Tan AS.Tetrazolium dyes as tools in cell biology:new insights into their cellular reduction［J］.Biotechnol Annu Rev，2005，(11):127-152.

［3］ Fallon AM，Hellestad VJ.Standardization of a colorimetric method to quantify growth and metabolic activity of Wolbachiainfected mosquito cells［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2008，44(8-9):351-356.

［4］ Ferrari Mde L，Telles MA，F(xiàn)errazoli L，et al.Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to first-line antimycobacterial agents in a Brazilian hospital:assessing the utility of the tetrazolium(MTT)microplate assay［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2010，105(5):661-664.

［5］ 謝誠，錢美英，繆麗燕.MTT法測定腫瘤細(xì)胞藥物敏感性

與臨床用藥［J］.藥學(xué)與臨床研究，2007，15(5):393-395.

［6］魏鴻剛，李元廣，劉健，等.一種快速的活菌計(jì)數(shù)新方法研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2002，29(2):89-93.

［7］ Shi YJ，Chen J，Xu M.A new method for antimicrobial susceptibility testing of vitro-cultured bacteria by means of resonance light scattering technique［J］.J Microbiol Biotechnol，2008，18(1):118-123.

［8］ 管遠(yuǎn)志，王艾琳，李堅(jiān)，等.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:82-89.

［9］ 周建軍，樂秀芳，韓家嫻，等.評價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24(10):455-457.

［10］ ISBN 1-56238-536-4，Quality control for commercially prepared microbiological culture media;Approved standard［S］.