家蠶細小病毒樣病毒(BmPLV-Z)VD1 ORF4的原核表達

李國輝，唐琦，張俊紅，郭旭麗，胡朝陽，姚勤

(江蘇大學生命科學研究院，江蘇鎮江212013)

家蠶細小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-like virus，BmPLV)是一類無囊膜包被的、單鏈、雙分子DNA病毒，具有20面體結構，大小約19～24 nm，能特異性感染家蠶中腸柱狀上皮細胞，導致家蠶罹患軟腐病［1-2］。本研究小組于2005年完成了鎮江株基因組的克隆和測序，其序列分析表明該病毒基因組為線性、單鏈雙分子DNA，其中VD1由6 543個核苷酸組成，理論上含有4個開放讀碼框;VD2由6 022個核苷酸組成，理論上含有2個開放讀碼框［3］。VD1序列分析進一步表明其基因組內含有一個大的開放讀碼框(命名為ORF4)，由3 318個核苷酸組成，理論上編碼1個含有1 115個氨基酸組成的蛋白，同源搜索發現該蛋白質與以蛋白為引物的DNA聚合酶B家族同源，該蛋白氨基酸一級序列706～1 004位點處存在5個保守的區域:Dx2SLYP(motifⅠ)，Kx3NSxYG(motifⅡ)，Tx2G_AR(motifⅢ)，Yx-DTDS(motifⅣ)和KxY(motifⅤ)，這些區域與DNA聚合酶的功能有關，例如:DNA合成，dNTP結合，以及磷酸化水解等［4-5］。由此推測VD1 ORF4編碼的蛋白具有DNA聚合酶活性，可能負責病毒自身DNA的復制。鑒于該蛋白在感染組織中的真實分子量大小、在病毒復制、侵染過程中的具體作用未知以及鑒定其與宿主相互作用蛋白因子等方面的考慮，為此，獲得該蛋白的高效價抗體是一種常用且有效的研究手段。本研究擴增家蠶細小病毒樣病毒VD1 ORF4編碼DNA聚合酶的同源區，并將構建的表達載體轉化原核細胞中進行誘導表達，以表達的產物免疫昆明小鼠制備該蛋白的抗體。對VD1 ORF4理論上的編碼框序列進行生物學信息分析，在不發生移碼的基礎上發現其有18個可以采用的起始密碼子ATG，而選擇不同的ATG作為翻譯起始位點可以產生分子量大小不同的蛋白質，濃核病毒中很多蛋白正是通過核糖體對同一信使mRNA漏掃描翻譯而來的。為了研究VD1 ORF4讀碼框在原核表達系統中是否也有漏掃描現象，分別對VD1 ORF4編碼區全長(3 318 bp)以及具有相同的3'-末端而5'-端不同(2 163 bp)的2個DNA片斷進行克隆，對構建的表達載體在原核表達細胞中進行誘導表達，通過制備的多抗對原核表達產物進行Western blot分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌種攜帶家蠶細小病毒樣病毒VD1 ORF4全長的克隆質粒pMD18T-3 318 bp由本室保存;原核表達載體pET-30a質粒、克隆菌株大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α和表達菌株E.coli RosettaTM2(DE3)plysS均購自Novagen公司。雄性昆明小鼠購自江蘇大學動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑限制性內切酶EcoRI、XhoI、BamHI、Taq酶、LA Taq酶、250 bp DNA Ladder Marker、蛋白質Marker(低分子量和高分子量)均購自TaKaRa公司;質粒提取和膠回收試劑盒購自Omega公司;蛋白質預染MarkerIII購自Fermentas公司;抗體純化試劑盒購自美國Millipore公司;氯霉素和IPTG購自上海生物工程有限公司，丙烯酰胺和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺購自Promega公司;Anti-His單抗購自Invitrogen公司;HRP標記的羊抗鼠二抗、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司;弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計參照BmPLV-Z基因組VD1 ORF4序列［3］，通過Primer Premier 5軟件設計5條引物:上游引物F1:5'-CCG GAATTCAAATGCCTTTAGTGAAGATTAC-3'和下游引物R1:5'-CCG CTCGAG TTATTCAATTACAACATCATC-3'擴增VD1 ORF4全長3 318 bp;上游引物F2:5'-CCG GAATTC ATGTTTTTAACTGATTTATATAGTA-3'和下游引物R1:5'-CCG CTCGAG TTATTCAATTACAACATCATC-3'擴增VD1 ORF4 2 163 bp，擴增的這2個目的DNA片斷具有相同的3'-末端而5'-端不同，它們兩端分別引入了EcoRI和XhoI酶切位點;同時，設計了2條引物用來擴增VD1 ORF4 DNA聚合酶同源編碼區，這2條引物分別為:上游引物F3:5'-AT GGATCCGTTTATCTTGATGTAT-3'和下游引物R2:5'-AA CTCGAGTTATAAGGCATTCTTA，引物兩端分別引入了BamHI和XhoI 2個酶切位點。

1.2.2 PCR擴增和重組子的構建以pMD18T-3 318 bp為模板、以F1/R1、F2/R1為引物對，通過LA Taq酶分別進行擴增，反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸3 min，35個循環，最后72℃延伸10 min，以EcoRI和XhoI對純化的PCR產物進行雙酶切，將回收后的目的片斷與經同樣雙酶切的表達載體pET30a進行連接，將連接產物轉化DH5α感受態細胞，對平板上的克隆進行鑒定，目的重組質粒命名為pET30a-3 318 bp和pET30a-2 163 bp;同樣，以pMD18T-3 318 bp為模板、以F3/R2為引物對，通過Taq酶進行擴增DNA聚合酶同源區，反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性40 s、53℃退火40 s、72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸10 min，以BamHI和XhoI對純化的PCR產物進行雙酶切，將回收后的目的片斷與經同樣雙酶切的表達載體pET30a進行連接，將連接產物轉化DH5α感受態細胞，對平板上的克隆進行鑒定，目的重組質粒命名為pET30a-1 077 bp。

1.2.3 融合蛋白的誘導表達、鑒定和多克隆抗體的制備將重組質粒pET28a-1 077 bp轉化E.coli RosettaTM2(DE3)plysS感受態細胞。挑取鑒定正確的陽性克隆接種3 mL LB培養基，37℃搖床培養過夜，次日按1∶100轉接，至OD600為0.5，通過加入不同濃度的IPTG(0、0.2、0.5、0.8、1.0 mmol/L)對其進行誘導，37℃誘導6 h，對收集菌體中的目的蛋白進行12%的SDS-PAGE檢測，通過抗6×His標簽的單抗對目的蛋白N-端融合的6×His Tag進行免疫印跡分析，進而確定誘導的蛋白帶為目的蛋白。采用割膠回收的方法對融合蛋白進行純化:直接從SDS-PAGE膠上割取所需要的目的帶，用PBS洗滌過夜，將小膠塊與適量的PBS混合，總體積不超過2 mL，研磨成勻漿。純化的融合蛋白與等體積的弗氏佐劑乳化后對昆明小鼠皮下多點注射［6］。

1.2.4 重組子(pET30a-3 318 bp和pET30a-2 163 bp)的誘導表達和Western blot分析將構建的兩種重組子轉化宿主表達菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS，挑取鑒定正確的陽性克隆接種3mL LB培養基中，通過0.8 mmol/L IPTG對其進行誘導表達，超聲破碎后，對上清與沉淀分別進行SDS-PAGE和Western blot分析，進而分析VD1 ORF4在原核表達系統中能否選擇不同的ATG作為起始密碼子來啟動蛋白的翻譯，同時對表達質粒pET30a-3 318 bp和pET30a-2 163 bp在原核宿主中目的蛋白的表達情況進行比較。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pET30a-1 077 bp、pET30a-2 163 bp和pET30a-3 318 bp的構建

以pMD18T-3 318 bp為模板，以F3/R2、F2/R1和F1/R1分別為引物對進行PCR擴增，分別擴增到一條大小為1 077、2 163和3 318 bp的特異片段，將雙酶切后的PCR產物連接到同樣雙酶切后回收的pET30a載體上，對獲得的重組質粒分別命名為pET30a-1 077 bp、pET30a-2 163 bp和pET30a-3 318 bp。對構建的目的質粒分別進行PCR擴增、BamHI/XhoI以及EcoRI/XhoI雙酶切鑒定，電泳結果與理論預計一致，3個片斷的測序結果與NCBI網上公布的序列完全一致，表明已成功擴增到VD1 ORF4 3個不同區域的DNA片斷，3個擴增片斷都已成功連接到原核表達載體pET30a上。

圖1 重組表達質粒的酶切鑒定Fig.1 Restriction analysis of the constructed recombinant plasmid

2.2 VD1 ORF4 DNA聚合酶同源編碼區序列(1 077 bp)在E.coli中的誘導表達

將構建的重組質粒pET30a-1 077 bp轉入宿主表達菌株E.coli RosettaTM2(DE3)plysS后，通過不同濃度的IPTG對其進行誘導，5 h后收菌并對處理的菌體進行SDS-PAGE電泳，結果表明:在44 ku處出現了1條特異的誘導蛋白帶，比預期大小略大(圖2A3～6);而空白對照在相應的位置上沒有出現誘導的蛋白帶(圖2A1)。通過Anti-His單抗對誘導蛋白帶進行Western blot檢測，結果發現僅在目的蛋白處有一明顯的雜交信號條帶(圖2B2)，表明誘導的目的蛋白成功地進行了融合表達。

圖2 靶蛋白在大腸埃希菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS中的表達和Western blot分析Fig.2 Identification and confirmation of target protein expressed in E.coli RosettaTM2(DE3)plysS by analysis of SDS-PAGE and Western blot

2.3 抗體的純化

將原核表達的重組蛋白經割膠純化后，用作抗原免疫昆明小鼠。2個月后，摘取小鼠眼球進行采血獲得抗血清。對經Millipore公司抗體純化試劑盒(PROSEP-A Media)純化后的抗體進行SDS-PAGE凝膠電泳。結果表明:在22 ku和50 ku處各出現一條帶(圖3)，說明抗體純化的效果較好，可用于下一步研究之中。

圖3 多克隆抗體的純化Fig.3 Purification of polyclonal antibody using Millipore kit

2.4 VD1 ORF4全長(3 318 bp)和部分長度(2 163 bp和1 077 bp)在E.coli中的表達

將構建含有VD1 ORF4全長和部分長度的DNA重組質粒:pET30a-3 318 bp、pET30a-2 163 bp和pET30a-1 077 bp分別轉入宿主表達菌株E.coli RosettaTM2(DE3)plysS后，通過0.8 mmol/L的IPTG對其進行誘導，5 h后收集菌體并對其進行超聲破碎，對超聲破碎后的沉淀和可溶性上清分別進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果表明:含有pET30a-3 318 bp重組質粒的宿主菌在120 ku處出現了1條特異誘導帶(圖4A2);含有pET30a-2 163 bp重組質粒的宿主菌在88 ku處出現了1條特異誘導帶(圖4A3);含有pET30a-1 077 bp重組質粒的宿主菌在44 ku處出現了1條特異誘導帶(圖4A4);而它們的對應上清中在理論位置上都沒有出現很明顯的特異誘導帶，說明它們的誘導表達產物主要是以包涵體的形式存在。

為了進一步分析VD1 ORF4序列中的不同ATG作為起始密碼子的可能性(不發生移碼突變)，理論上除了一條主要目的帶之外，泳道中還應有其他漏掃描表達蛋白帶，鑒于這種考慮，通過制備的多抗對上述誘導的蛋白產物進行Western blot分析，結果發現3個泳道中都只出現了1條特異的雜交帶，這些帶的位置與它們在SDSPAGE中出現的特異帶位置相一致，該結果表明VD1 ORF4在原核表達系統中的產物均一，在蛋白質合成過程中沒有發生漏掃描現象。

圖4 靶蛋白在大腸埃希菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS中的表達和Western blot分析Fig.4 Identification and confirmation of target protein expressed in

3 討論

將BmPLV-Z VD1 ORF4編碼的理論序列在Swissprot蛋白數據庫中進行Blast搜索，結果發現該蛋白與DNA聚合酶B家族同源，推測BmLV-Z VD1 ORF4編碼的蛋白很可能是一個DNA聚合酶，并引導病毒自身DNA的復制，但該蛋白的真實分子量大小還未知，是否具有DNA聚合酶的功能以及和宿主哪些蛋白發生作用?為此，本文對BmPLV-Z VD1 DNA聚合酶同源編碼區片斷進行PCR擴增，將雙酶切回收后的DNA片段與原核表達載體pET30a進行連接，對目的重組子進行序列測定，其結果與理論上的序列完全一致。對捕獲有目的重組質粒的大腸埃希菌E.coli RosettaTM2(DE3)plysS進行IPTG誘導，SDS-PGAE結果表明目的片段在原核細胞中實現了融合表達，Anti-His單抗對誘導的蛋白帶進行免疫印跡分析結果證實了其表達。

本實驗室曾將構建的表達質粒轉化E.coli BL21/DE3宿主表達菌，但是多次誘導條件的摸索，包括調整IPTG的誘導濃度、誘導時間以及誘導溫度，始終未見明顯的目的蛋白誘導表達條帶。在對目的基因片段VD1-ORF4/2 163 bp進行稀有密碼子的分析之后，發現該段基因序列中稀有密碼子比例較高，接近6%。根據這一分析結果，改用了RosettaTM2(DE3)plysS宿主表達菌。RosettaTM2(DE3)pLysS是BL21的衍生菌，該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質粒，補充了稀有密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs，能明顯增強帶有大腸埃希菌稀有密碼子的蛋白的表達。改換了宿主表達菌后，即可檢測到目的蛋白的表達條帶，即使這樣，VD1 ORF4長短不同的3個DNA片段在RosettaTM2(DE3)plysS宿主表達菌中的表達量彼此之間也相差很大，其中VD1 ORF4全長3 318 bp的表達量最低，2 163 bp的表達量稍高，1 077 bp的表達量最高，說明稀有密碼子在這3個DNA片段中的分布頻率和分布位置不同，同時也說明宿主菌的選擇對外源基因的表達也是非常重要的。

漏掃描現象指的是mRNA在翻譯為蛋白質的過程中，核糖體忽略了上游的位于非最優的AUG起始位點，而以下游的AUG為起始位點合成蛋白質多肽鏈;除受AUG位點上下游序列的影響，RNA的結構和其他結合蛋白、調控因子等其他的因素對翻譯起始也有著重要的影響［7-8］。大蠟螟濃核病毒(GmDNV)4個分子量大小不一的核衣殼蛋白，它們具有不同的N-端序列，但C-端氨基酸序列是相同的，研究表明這是通過起始同一條mRNA轉錄本中不同的AUG密碼子而來的［9］;Mythimna loreyi densovirus(MlDNV)的4個核衣殼VP蛋白也是同一條mRNA通過漏掃描翻譯而來的［10］;庫蚊濃核病毒(CpDNV)的4個核衣殼蛋白也是核糖體在mRNA上通過漏掃描產生的［11］，漏掃描或許是細小病毒在長期進化過程中有利于病毒生存的一種蛋白質合成機制。本研究

通過制備的VD1 ORF4部分肽段的多克隆抗體對VD1 ORF4全長和部分DNA序列在原核中的表達情況進行初步分析，結果表明3個泳道中都只檢測到1條特異的蛋白帶(圖4)，它們彼此之間的表達量有明顯差異，這與它們mRNA各自的序列特征密切相關;而未檢測到漏掃描合成的蛋白，這或許與多種因素相關:比如原核表達質粒pET30a中的AUG始終為最優的起始翻譯位點、原核宿主細胞內外源基因的表達不能真實反應病毒基因在真核宿主細胞內的表達情況以及病毒VD1 ORF4基因在家蠶細胞內確實只表達為一個蛋白等，為此，這還有待于對VD1 ORF4編碼的蛋白在感染細胞中的真實表達情況進行下一步研究，除此之外，本文所制備的VD1 ORF4部分肽段的多克隆抗體為該蛋白的定位、互作蛋白的鑒定以及探討病毒與宿主之間的相互作用提供了研究基礎。

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