生物學(xué)效應(yīng)分析—心理性應(yīng)激和軀體性應(yīng)激對鼠脾殺傷細胞影響的異同

王佐周，聶影，傅煒昕，孫贊，崔敬惠，梁再賦*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，遼寧沈陽110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心暨國家中藥管理局中藥生物工程實驗室(Ⅲ級)，遼寧沈陽110001)

NK細胞、CTL細胞是機體免疫的主要殺傷細胞，研究表明，應(yīng)激可降低殺傷細胞功能，但其詳細機制尚不清楚，特別是尚未見到從心理性應(yīng)激(phsychological stress)和軀體性應(yīng)激(physical stress)對殺傷細胞活性的影響異同角度進行研究的報道。本實驗選用應(yīng)激動物模型，觀察了心理性應(yīng)激和軀體性應(yīng)激對鼠脾NK、LAK(Lymphokine-activad Killer cell)、CTL細胞殺傷活性的影響，以闡明心理性應(yīng)激和軀體性應(yīng)激降低鼠脾殺傷細胞殺傷活性的機制及異同。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物8周齡C57BL/6純系雌性小鼠購于日本クレァ會社，在空氣控制級別為SPF級，室溫(23±1)℃，濕度(55±5)%，明暗條件12 h轉(zhuǎn)換(6點開燈，18點熄燈)的環(huán)境下，觀察飼養(yǎng)1周后用于實驗。觀察飼養(yǎng)及正常實驗期間任其自由攝取無菌食物和水。實驗動物隨機分成心理性應(yīng)激組、軀體性應(yīng)激組和非應(yīng)激對照組3組，每組7只。

1.1.2 試劑與儀器51Cr-鉻酸鈉購于美國NEN公司;人類重組IL-2(rIL-2)由Takeda化工會社(日本)友情贈送。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)激負荷法使用Communication box系統(tǒng)(MUROMACHI KIKAI CO.，LTD日本)負荷應(yīng)激，箱內(nèi)部由透明的聚丙烯板分為4個A區(qū)(底部敷設(shè)塑料板)和5個B區(qū)(底部敷設(shè)金屬格子)。放入B區(qū)的小鼠由于足部受到電擊，出現(xiàn)跳躍、排便、嘶叫及氣味等應(yīng)激反應(yīng)。與此相對，A區(qū)內(nèi)的小鼠雖然沒有受到直接的電擊刺激，但由于暴露于B區(qū)小鼠的應(yīng)激反應(yīng)環(huán)境中而受到心理性應(yīng)激刺激。本研究通過對B區(qū)內(nèi)的小鼠施加0.6 mA的電流刺激，刺激時間1 s，1 h內(nèi)共120 s的隨機性電刺激使B區(qū)和A區(qū)的小鼠分別負荷軀體性應(yīng)激和心理性應(yīng)激刺激。

1.2.2 脾細胞懸液的制備在連續(xù)負荷應(yīng)激3 d后(AM10.00)，腹腔注射10%巴比妥鈉0.2 mL而處死，無菌取脾，研碎，200目鋼網(wǎng)濾過，以得到單個脾細胞。離心，棄上清，沉淀中加入0.83%Tris-NH4Cl液溶解紅細胞后，以1640液洗滌2次，用10%FCS-1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度為2.5×107備用。

1.2.3 殺傷細胞活性測定采用微量51Cr-鉻酸鈉釋放法測定NK、LAK及CTL細胞活性。①鼠LAK細胞的誘導(dǎo):取2×106/mL脾細胞1 mL加入12孔培養(yǎng)板中，用含有575 u/mL的rIL-2的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)120 h。以1640液洗滌4次，用10%FCS-1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度為2.5×107備用;②CTL細胞的誘導(dǎo):致敏靶細胞制備:取對數(shù)生長期的YAC-1細胞，用1640液洗滌2次，用1640液調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，以Mitomycin C 100 μg/mL(Sigma)37℃處理30 min后，用1640液洗滌4次，以10%FCS-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×107/mL;CTL細胞的誘導(dǎo):把C57BL/6(H-2b)小鼠脾細胞以5×106/mL濃度與Mitomycin C處理的致敏YAC-1細胞(H-2a)以105/mL的濃度按50∶1的比率在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 d后，以1640液洗滌4次，用10%FCS1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度為2.5×107/mL備用;③靶細胞的標記:取對數(shù)生長期的YAC-1細胞，用1640液洗滌2次，用10%FCS1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，0.1 mL YAC-1細胞懸液加3.7 MBq(100 uci)51Cr，5%CO2條件下孵育60 min，每隔15 min振蕩1次。1640液洗滌4次，以洗去未標記的游離51Cr;④殺傷活性測定:取靶細胞0.1 mL(1×105/mL)加入96孔圓底微量板中，然后加入不同比例的效應(yīng)細胞0.1 mL，使E/T(效應(yīng)細胞/靶細胞)比率分別為100∶1、50∶1和25∶1，一式3份，同時設(shè)自然釋放孔(0.1 mL靶細胞+0.1 mL 10%FCS RPMI-1640)和最大釋放孔(0.1 mL靶細胞+0.1 mL 0.2%TritorX)，37℃，5%CO2條件下孵育4 h。將微量板以1 500 r/min離心5 min，吸取各孔上清0.1 mL加于計數(shù)管內(nèi)，以自動計數(shù)儀(1470WiandTM，perkin Elmer)測定cpm值/min。根據(jù)下式計算細胞毒活性:細胞毒活性(%)=(實驗組cpm值-自然釋放組cpm值)/(最大釋放組cpm值-自然釋放組cpm值)×100%。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以ˉχ±S表示，組間比較采用方差分析，統(tǒng)計軟件SPSS 10.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 心理性和軀體性應(yīng)激對小鼠脾NK細胞殺傷活性的影響

實驗結(jié)果顯示，負荷心理性應(yīng)激和軀體性應(yīng)激3 d后與對照組比較，兩者在效/靶比例為1∶50、1∶100時均可降低鼠脾NK細胞殺傷活性(P＜0.01)。但2種應(yīng)激反應(yīng)對NK細胞活性的影響無顯著差異(表1)。

2.2 心理性和軀體性應(yīng)激對小鼠脾LAK細胞殺傷活性的影響

如表2所示，E/T比率為1.25時，與對照組比較兩者明顯降低小鼠LAK細胞活性(P＜0.01)，但這2種應(yīng)激反應(yīng)對LAK細胞活性的影響無顯著差異(表1)。

2.3 心理性和軀體性應(yīng)激對小鼠脾CTL細胞殺傷活性的影響

如表3所示對照組比較，心理性應(yīng)激和軀體性應(yīng)激都可明顯降低C57BL/6小鼠脾CTL細胞活性(P＜0.001)，軀體性應(yīng)激比心理性應(yīng)激對CTL細胞活性有較強的抑制作用(P＜0.05)。

表1 應(yīng)激對小鼠脾NK細胞活性的影響(%)Table 1 Effects of stress on activity of splenic NK cell in C57BL/6 mic(%)

表2 應(yīng)激對小鼠脾LAK細胞活性的影響(%)Table 2 Effects of stress on activity of splenic LAK cell in C57BL/6 mic

表3 應(yīng)激對小鼠脾CTL細胞活性的影響(%)Table 3 Effects of stress on activity of splenic CTL cell in C57BL/6 mic(%)

3 討論

應(yīng)激(stress)是機體在對生存環(huán)境中多種不利因素適應(yīng)過程中，實際或認知上的要求與適應(yīng)和應(yīng)付能力之間不平衡導(dǎo)致的身心緊張狀態(tài)及其反應(yīng)。其主要特征為機體受到內(nèi)外環(huán)境刺激后發(fā)生下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸及交感腎上腺髓質(zhì)活性增強。研究表明，應(yīng)激主要通過間接途徑激活室旁核分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，從而促進腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的大量分泌。而ACTH的升高與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。應(yīng)激還可通過抑制免疫功能［1-2］，使機體易發(fā)感染、自身免疫性疾病和腫瘤等疾?。?-4］。

NK細胞是固有免疫的主要細胞，屬于淋巴細胞譜系細胞群，通過分泌細胞毒性顆粒無需致敏就可直接殺傷腫瘤和病毒感染靶細胞或通過分泌多種細胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細胞的免疫功能，參與免疫系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展及效應(yīng)等重要環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)過程。NK細胞與靶細胞結(jié)合后，以Fas/FasL途徑和釋放穿孔素(Perforin)、顆粒性溶解酶(Granzyme)、顆粒性溶解素(Granulysin)2種方式誘導(dǎo)靶細胞發(fā)生凋亡而殺傷靶細胞［5-7］。

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn):慢性應(yīng)激可顯著降低鼠脾NK細胞的殺傷活性，減少脾NK細胞的數(shù)量［8］;癌癥病人在外科手術(shù)的應(yīng)激下，NK細胞數(shù)量和活性均下降［9］。在對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的退伍軍人的研究中發(fā)現(xiàn)［10］:其NK細胞的細胞毒性顯著下降。以上研究均表明，應(yīng)激可以抑制NK細胞功能，但生理和心理應(yīng)激對NK細胞作用的差別卻未見報道。

有研究證實，應(yīng)激種類的不同，腦賦活的經(jīng)絡(luò)也有所不同。心理性應(yīng)激時，首先興奮大腦皮質(zhì)和邊緣系，其信息傳遞至扁桃體中心核(Ace)和分界條床核(BST)激活丘腦下部室旁核(PVN)及PHA軸，Ace、BST及PVN等也投射至腦干的植物神經(jīng)核，參與應(yīng)激，導(dǎo)致植物神經(jīng)癥狀的表現(xiàn)。而末梢的炎癥等軀體性應(yīng)激刺激，其變化經(jīng)血行性腦弓下器官最后傳遞至腦;對生命有威脅的軀體性應(yīng)激，其末梢信息直接傳遞至PVN。因而，在研究應(yīng)激對免疫功能的影響時，比較生理和心理應(yīng)激反應(yīng)間的差別是重要的。

本實驗選用應(yīng)激動物模型，觀察了軀體性應(yīng)激和心理性應(yīng)激對鼠脾NK、LAK、CTL細胞殺傷活性的影響，結(jié)果顯示軀體性應(yīng)激和心理性應(yīng)激可導(dǎo)致鼠脾NK細胞、LAK細胞殺傷活性降低;迄今為止，仍無關(guān)于心理應(yīng)激反應(yīng)影響LAK細胞活性的報道。

軀體性應(yīng)激和心理性應(yīng)激兩者均可明顯降低CTL細胞活性，與文獻報道一致［11］。實驗結(jié)果顯示，軀體性應(yīng)激比心理性應(yīng)激對CTL細胞活性有較強的抑制作用。

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