白蟻共生放線菌的抗菌活性篩選及菌株BY02的初步鑒定

胡松英，張應(yīng)烙，2*，黃娟翠，方鄭，黃如柏，向婷婷

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004;2.南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210093)

放線菌是產(chǎn)生抗生素最多的一類微生物，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素80%是由放線菌產(chǎn)生的，但研究放線菌的對(duì)象長期集中在來自土壤、水體等環(huán)境微生物，從中分離得到的化合物往往是已知化合物，出現(xiàn)全新骨架活性化合物的幾率已經(jīng)很低，趨同的環(huán)境和重復(fù)的研究使得新天然藥物的發(fā)現(xiàn)率從上世紀(jì)80年代開始逐年下降。但與此同時(shí)，近年來在制藥領(lǐng)域的進(jìn)步也使得人們對(duì)藥用活性物質(zhì)的來源與特性有了更高的要求，已有結(jié)構(gòu)特征的化合物不能適應(yīng)病原的快速變化，而傳統(tǒng)來源的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的途徑也難以滿足具有新結(jié)構(gòu)特征或新作用特點(diǎn)化合物發(fā)現(xiàn)的需要。因此，為了發(fā)現(xiàn)新型天然藥源分子，尋找新的特境微生物資源顯得尤為必要。昆蟲共生菌是一類研究較少的特境微生物，是新穎天然產(chǎn)物的廣泛來源［1］。在較系統(tǒng)研究大刀螳螂、棉蝗和負(fù)蝗共生菌活性代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上［2-4］，活性篩選表明1株黑翅土白蟻共生放線菌具有較好的抗菌活性，本文報(bào)道該活性菌株并初步確定其分類地位，旨在為開發(fā)新型微生物源殺菌劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集供試黑翅土白蟻采自浙江師范大學(xué)校園內(nèi)。

1.1.2 供試植物致病菌供試植物致病菌為:蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、楊樹潰瘍病菌(Dothiorella gregaria)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 共生放線菌的分離及其發(fā)酵產(chǎn)物的提取

利用平板分離法從黑翅土白蟻中分離到10株共生放線菌［4］，將分離到的10株菌株分別接種于

裝有50 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中，30℃、150 r/min條件下，搖床培養(yǎng)7 d。所得發(fā)酵液經(jīng)6～8層紗布過濾，濾液分別用乙酸乙酯萃取3次，萃取液經(jīng)減壓濃縮得粗浸膏。用丙酮定容，使粗浸膏最終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

1.2.2 BY02發(fā)酵產(chǎn)物不同極性物質(zhì)的提取參照1.2.1，對(duì)BY02進(jìn)行液體發(fā)酵并得到發(fā)酵濾液，濾液依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液經(jīng)減壓濃縮得二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。用丙酮定容，使各提取物最終質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL。

1.2.3 共生放線菌提取物抑菌活性測定采用生長速率法測定發(fā)酵提取物對(duì)植物病原菌的抑制活性［2］，具體操作過程參照馮俊濤等［5］方法。帶毒培養(yǎng)基的制備:取所制備的白蟻共生放線菌提取物1 mL于滅菌的10 mL試管中，加入9 mL 50℃左右PDA培養(yǎng)基，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中即成，使帶毒培養(yǎng)基中提取物的最終質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，以等量丙酮作為陰性對(duì)照。將活化的植物病原菌用無菌平板打孔器打成直徑5 mm的菌塊，置于培養(yǎng)基上，每處理3次重復(fù)，培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量供試菌菌落直徑。按如下公式計(jì)算抑制率:抑制率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5 mm)×100%。

1.2.4 BY02菌株鑒定①BY02形態(tài)特征觀察:采用插片法，將菌種接種于高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基上，30℃插片培養(yǎng)6～15 d后，取插片在高倍鏡下觀察菌絲及孢子絲的形態(tài)特征，按照《鏈霉菌鑒定手冊》對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定［6-7］;②16S rRNA基因序列分析:用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品的基因組DNA，采用通用引物7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1 540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?98℃5 min，95℃35 s，55℃35 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。獲得的16S rRNA序列提交GenBank并獲取登錄號(hào)。對(duì)菌株的16S rRNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似序列，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)菌株的形態(tài)和16S rRNA序列分析結(jié)果初步確定菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 10株共生放線菌提取物對(duì)3種植物病原菌菌絲生長的抑制作用

10株共生放線菌提取物對(duì)3種病原真菌菌絲生長抑制作用結(jié)果見表1。在供試質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，10株共生放線菌提取物對(duì)所有3種供試植物病原真菌菌絲生長均有一定的抑制作用;BY02提取物的抑菌活性最好，對(duì)所有供試菌抑制率均在80%以上，其中對(duì)蘋果腐爛病菌表現(xiàn)強(qiáng)烈抑制作用，抑制率為100%;BY01和BY06抑菌活性次之，對(duì)所有供試菌抑制率均在40%以上，其中對(duì)蘋果腐爛病菌也表現(xiàn)強(qiáng)烈抑制作用，抑制率為100%。

表1 10株共生放線菌提取物對(duì)植物病原菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibiting effect of extracts from ten actinomycete strains on hypha of plant pathogens

2.2 BY02發(fā)酵產(chǎn)物不同極性物質(zhì)對(duì)3種植物病原菌菌絲的生長抑制作用

BY02發(fā)酵產(chǎn)物不同極性物質(zhì)對(duì)3種病原菌菌絲的生長抑制作用結(jié)果見表2。從表中數(shù)據(jù)可看出，BY02發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物活性最好，對(duì)所有3種供試菌的抑制率均大于80%;BY02發(fā)酵產(chǎn)物的二氯甲烷提取物抑菌活性次之，對(duì)2種供試菌的抑制率均大于70%，BY02發(fā)酵產(chǎn)物的正丁醇提取物抑菌活性最差，僅對(duì)1種供試菌的抑制率大于70%。上述結(jié)果表明BY02發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性物質(zhì)主要集中在中等極性部分。

表2 BY02發(fā)酵產(chǎn)物不同極性物質(zhì)對(duì)植物病原菌菌絲的生長抑制作用Table 2 Inhibiting effect of different polar fractions from the strain BY02 on hypha of plant pathogens

2.3 BY02菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察在高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上，BY02的菌落干燥，質(zhì)地致密，與培養(yǎng)基結(jié)合緊，呈顆粒狀。采用插片法培養(yǎng)，鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲都發(fā)育良好，基內(nèi)菌絲無橫隔，不斷裂，顏色為黃褐色，不產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生黃色的可溶性色素;氣生菌絲彎曲、白色，氣生菌絲上產(chǎn)生螺旋狀孢子絲，孢子圓形。這些特點(diǎn)都與鏈霉菌的特征相符，初步鑒定該菌株為鏈霉菌屬(Streptomyces)放線菌。

2.3.2 16 S rRNA序列分析BY02的基因組DNA電泳圖譜及16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見圖1和2，BY02的基因組DNA片段在10 000 bp左右，其16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物為1 418 bp，該菌的16S rRNA基因序列已登錄于GenBank，獲取的登錄號(hào)為JF412027。菌株BY02與Streptomyces parvulus(AB184326)的同源性達(dá)99.5%，親緣關(guān)系最近，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支(圖3)。故將BY02菌株初步鑒定為Streptomyces parvulus。

圖1 菌株BY02的基因組DNA電泳圖Fig.1 Electeophoresis of BY02 genome

圖2 菌株BY02 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electeophoresis of result by PCR of BY02

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株BY02與鏈霉菌屬相關(guān)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of BY02 and representatives

3 小結(jié)與討論

本研究從黑翅土白蟻共生放線菌中篩選分離得到1株具有較好抗菌活性的菌株BY02，其抗菌活性物質(zhì)主要集中在中等極性部分，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA序列分析初步確定該菌株為Streptomyces parvulus。如前言部分所述，昆蟲共生菌是新穎天然產(chǎn)物的廣泛來源［1］，進(jìn)一步對(duì)菌株BY02的次生代謝產(chǎn)物研究，將有希望從中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的抗菌先導(dǎo)化合物，BY02作為微生物源殺菌劑值得進(jìn)一步研究。

［1］ 張應(yīng)烙.昆蟲腸道真菌的新活性物質(zhì)研究［D］.南京大學(xué)博士學(xué)位論文，2008.

［2］ Zhang Y L，Kong L C，Jiang D H，et al.Phytotoxic and antifungal metabolites from Curvularia sp.FH01 isolated from the gut of Atractomorpha sinens［J］.Bioresource Technology，2011，102(3):3575-3577.

［3］ Zhang Y L，Ge H M，Li F，et al.New phytotoxic metabolites from Pestalotiopsis sp.HC02，a fungus residing in Chondracris rosee gut［J］.Chemistry and Biodiversity，2008，5(11):2402-2407.

［4］ Zhang Y L，Ge H M，Zhao W，et al.Unprecedented immunosuppressive polyketides from Daldinia eschscholzii，a mantis-associated fungus［J］.Angewandte Chemie International Edition，2008，47(31):5823-5826.

［5］ 馮俊濤，石勇強(qiáng)，張興.56種植物抑菌活性篩選試驗(yàn)［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29(2):65-68.

［6］ 中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，1975.

［7］ 閻遜初.放線菌的分類和鑒定［M］.北京:科學(xué)出版社，1992.