起始pH值對海洋混合菌群產氫量的影響

劉洪艷, 王廣策

(1. 天津市海洋資源與化學重點實驗室, 天津科技大學 海洋科學與工程學院, 天津 300457; 2. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071)

起始pH值對海洋混合菌群產氫量的影響

劉洪艷1,2, 王廣策2

(1. 天津市海洋資源與化學重點實驗室, 天津科技大學 海洋科學與工程學院, 天津 300457; 2. 中國科學院海洋研究所, 山東 青島 266071)

對采自天津潮間帶的污泥進行熱休克處理, 厭氧條件下富集混合菌群進行產氫試驗; 設置起始pH從4.0到8.0(間隔0.5個單位), 比較混合菌群在不同pH培養條件下產氫量; 利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析不同起始pH培養條件下的混合菌群組成。結果表明, 在起始pH為7.0時, 混合菌群產氫量最高。不同起始 pH 對產氫量的影響, 依次為 pH 6.5＞ pH 7.5 ＞ pH 8.0 ＞ pH 6.0 ＞ pH 5.5 ＞ pH 5.0 ＞ pH 4.5 ＞ pH 4.0?；旌暇?6S rRNA基因的PCR擴增產物經DGGE分離, 電泳圖譜表明, 不同起始pH條件下混合菌群的優勢菌相同, PCR產物的測序結果與Clostridiumsp.存在比較高相似度(98%)。Fe-氫酶基因擴增產物在DGGE電泳圖譜中存在一條特異條帶, 其測定序列與Clostridium perfringens氫酶基因相似度為 98%。不同起始 pH條件下混合菌群的產氫菌基本相同, 混合菌群產氫量之間的差異可能在于起始pH對混合菌群Fe-氫酶基因活性的影響, 有待進一步研究確定。

起始pH; 產氫量; 變性梯度凝膠電泳; 16S rRNA基因; Fe-氫酶基因

化石能源日益耗竭引發的能源問題, 在最近幾年中越來越受到關注。以生物質為原料獲得例如酒精, 柴油, 甲烷和氫氣等燃料的生物能源方式, 以可再生的特點能夠滿足實際和未來的能源需求而成為研究的熱點[1]。氫氣的單位燃燒值要高于任何燃料[2]而且燃燒產物無污染, 在工業上應用廣泛, 包括氨、酒精、乙醛的合成, 石油的氫化, 已被應用到能源、工業和航空等領域。隨著全球能源短缺的問題日益嚴峻, 國際上對可再生能源表現出濃厚的興趣, 氫氣的研究已經成為能源領域的研究焦點[3]。制氫的方法有物化法和生物法, 其中生物制氫中的混合菌發酵產氫方式不但能有效處理有機廢水(泥)而且還能低成本制得氫氣, 相對比純菌種制氫方式更具有實際應用前景。自 2000年以來, 利用有機廢水(泥)的混合菌發酵制氫方式日益受到重視[4]。

影響混合菌群產氫效率因素主要有[5-7]氮源和碳源的濃度, 氫氣分壓, 耗氫菌對氫氣的利用, 培養液的pH。雖然氫氣量能夠隨著碳源濃度的升高而增加,但是過高的碳源濃度將有利于細菌代謝途徑中轉向乙醇代謝而降低了氫氣產量[8]。Mizno等[9]報道, 低的氫氣分壓將有助于提高產氫量。在混合菌發酵制氫中, 解決耗氫菌對氫氣的消耗與提高氫氣的累積量是同等重要, 這是能否運用到產業化實際中的關鍵。一般認為, 耗氫菌對逆境條件比較敏感, 而產氫菌(尤其是研究最多的梭菌屬)能夠應對苛刻環境條件。選擇適當的產氫污泥預處理方法將會抑制耗氫菌而仍然保持產氫菌的產氫效率[10]。熱休克方法是最常用的方法, 經過熱處理能夠激活混合菌中產生芽孢的梭菌屬而抑制不能形成芽孢的耗氫菌[11]。因此選擇合適的預處理方式將會提高混合菌群的產氫能力。除了以上這些影響氫產量的因素, 培養液的pH顯得尤為關鍵, 因為 pH能夠影響微生物代謝類型[12]。目前關于混合菌發酵產氫的最適pH報道存在不一致, Lay等[13]在以淀粉為底物的實驗中認為最適pH是4.7～5.7, Lee等[14]報道在利用蔗糖為底物情況下, 最適 pH是9, 而 Ren等[15]研究認為最適pH是4.0～4.5。即使在同樣利用葡萄糖為底物的實驗中,不同研究者報的最適 pH也不一致, 變化范圍為5.0～6.7[4]。

目前利用有機廢水進行微生物制氫技術多集中在淡水系統, 在沿海城市中, 由于淡水資源的缺乏,海水的利用率在逐年加大, 加之海水養殖產生的廢水(泥), 造成高鹽的海水有機廢水(泥)大量累積, 利用海洋有機廢水進行微生物制氫的前提是從海洋環境中篩選高效的產氫菌群或菌株。

變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE )技術作為目前研究微生物遺傳多樣性最有力的分子生物學技術, 在生物制氫研究中應用比較少[16], 更未見有關海洋產氫微生物菌群的相關分析。在本實驗中, 研究不同起始pH對從海洋環境中富集的產氫混合菌群相關產氫性質的影響。利用DGGE分析在不同起始pH培養條件中混合菌群的優勢菌屬組成,為海洋有機廢水的混合菌發酵產氫研究在產業化實際應用中提供相關參數。

1 材料與方法

1.1 產氫混合菌群富集與培養

污泥取自天津海水浴場潮間帶。液體培養基參照 文獻[17]稍有修改, 成分如下(g/L)： 葡萄糖 20,胰蛋白胨 4, 牛肉膏 2, 酵母提取物 1, NaCl 30,K2HPO41.5, MgCl20.1, FeSO4·7H2O 0.1, L-半胱氨酸0.5, 維生素液 10 mL/L(VB120.01, VC 0.025, VB20.025, 檸檬酸 0.02, VB60.05, 葉酸0.01), 微量元素液 10 mL/L(MnSO4·7H2O 0.01, ZnSO4·7H2O 0.05,H3BO30.01, CaCl2·2H2O 0.01, Na2MoO40.01,CoCl2·6H2O 0.2), 刃天青(0.1%)1mL, pH 7.2。取 10 g污泥于121 ℃熱休克處理10 min, 室溫冷卻, 熱休克處理的污泥接種到100 mL培養基中, 充氮氣1 min ,于120 r/min, 37 ℃恒溫搖床中培養24 h。按1 ： 100接種比例連續培養 3次, 目的在于富集厭氧產氫混合菌群。獲得的混合菌液作為母液進行間歇產氣實驗。

1.2 產氫過程中相關理化因子的測定

利用1 mol/L HCl或NaOH調節培養液的起始pH, pH梯度分別為4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5和8.0。不同起始pH培養條件下的混合菌進行發酵產氣實驗, 連續厭氧發酵36 h。定時間隔用5 mL注射器取樣, 測定pH, OD和氧化還原電位(ORP)。pH和 ORP值采用 METTLER TOLEDO酸度計進行測量。

1.3 氫氣含量測定

氣體的收集采用排水法。氫氣含量的測定利用氣相色譜儀(Agilent, 型號 6820)測定發酵氣體中氫氣的含量。氮氣做載氣, 流量為25 mL/min, 色譜柱填料為5 A分子篩(60/80目), 柱長 2 m, 檢測器為熱導檢測器(TCD), 柱溫, 進樣器溫度和檢測器溫度分別為40, 200, 200 ℃。

1.4 16S rRNA基因和Fe-氫酶基因PCR擴增

分別以大多數細菌和古細菌的 16S rRNA基因V3 區通用引物[18]GC-357F： 5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和 517R： 5′-ATTACCGCGG CTGCTGG-3′ 和 Chang 等[19]設計的梭菌氫酶通用引物 E1F： 5′-GCTGATATGACAATAATGGAAGAA-3′和 E1R： 5′-GCAGCTTCCATAACTCCACCGGTTGCACC-3′, 進行PCR擴增, 擴增產物經瓊脂糖電泳檢測, 條帶單一即可以用做DGGE分離。

1.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

采用Bio-Rad公司Dcode TM的基因突變檢測系統對PCR產物進行分離。制備8 %的聚丙烯酰胺凝膠, 變性劑濃度 30 %～60 %, 在 150 V的電壓下,60 ℃電泳3 h。電泳結束后, 用AgNO3染色方法顯示, 切取目的條帶, 利用聚丙烯酰胺凝膠 DNA回收試劑盒(BIOFLUX)提取與純化 DNA, 并將此回收的DNA作為模板重新再擴增進行序列測定, 測序由上海生工生物工程有限公司完成。

2 結果與討論

2.1 起始 pH對混合菌發酵液終 pH和OD600的影響

不同起始pH培養條件下, 混合菌連續培養36 h后停止產氫, 測定混合菌發酵液的終止pH(圖1)。相對比起始 pH, 混合菌發酵液的終 pH都有不同程度下降。微生物厭氧發酵產氫過程中, 有機酸是伴隨氫氣的生成, 過多有機酸形成導致培養液 pH降低[20],結果會抑制產氫活動。發酵培養36 h時, 測定混合菌在不同起始pH培養條件下的菌濁(圖1), OD600值可以間接表示混合菌群的生長狀態。在起始 pH為7.5時, 混合菌的 OD600值最高, 而混合菌在 pH7.0時達到了最高產氫量。這表明混合菌最適生長pH與最適產氫的 pH是不吻合的。Jun等[3]報道了混合菌群的最適產氫 pH是 5.0, 而最適細胞生長的 pH為7.0。可見細胞的生長和產氫不是成比例的。Zhu等[17]研究結果表明微生物在利用碳源發酵產氫過程中,氫氣的產生是不利于細胞的生物量的累積。

圖1 不同起始pH對混合菌OD600和終止pH的影響Fig. 1 Effects of initial pH on OD600 and finial pH of mixed culture

2.2 起始pH對混合菌群產氫量的影響

混合菌群在底物為20 g/L葡萄糖的培養條件下,37℃連續培養36 h, 起始培養液的pH梯度4.0～8.0。起始pH對混合菌群產氫量有比較明顯的影響(圖2)。起始 pH為7.0時, 混合菌群獲得最大產氫量, 產氫量達到1.70 mol H2/mol± 0.05 mol H2/mol 葡萄糖。在pH 7.0到8.0之間, 隨著pH升高產氫量是下降的。在pH為4.0時, 產氫量比較微弱。pH 4.5～7.0產氫量隨著pH增加而升高, 最適產氫pH為7.0。在同樣以葡萄糖為底物條件下, 關于最適pH的報道也是有差異的。Fang等[4]和Lin等[21]報道混合菌最適pH分別是5.5和5.7, Kumar等[22]發現Enterobacter cloacae在 pH5.0～6.0達到最大產氫量, Kataoka等[23]報道Clostridium butyricum最適pH為6.7。相同葡萄糖作為底物, 研究者提出的最適pH存在差異, 可能是由于富集的優勢菌群不同所導致。例如Jun等[3]在研究不同pH對產氫量的影響時, 發現最適pH是5.0, 混合菌群中4個優勢菌株有3個是屬于腸桿科。

圖2 不同起始pH對混合菌產氫量的影響Fig. 2 Effect of initial pH on hydrogen production of mixed culture

2.3 起始 pH7.0培養條件下混合菌群 pH,ORP和OD600的變化

測定混合菌群在起始 pH為 7.0時相關產氫指標?；旌暇簆H, ORP和OD600在產氫過程中的變化見圖3?；旌暇寒a氫過程發生在12～24 h, 這與Valdez等[20]報道的產氫延遲時間小于14 h相一致?；旌暇涸诎l酵 24 h時細胞生物量的累積達到最高。產氫過程中pH從5.5降到4.3, 在比較低的pH仍有產氫行為, 說明這組混合菌的耐酸能力比較強。氧化還原電位(ORP)能夠作為產氫過程的一個實時監測指標, 因為發酵過程中, 高產氫率對應于發酵液的低ORP值[17], 產氫過程中(發酵時間12～24 h),ORP值范圍是-50 ～48 mV之間。

圖3 起始pH 7.0 培養條件下混合菌pH、ORP和OD600的變化Fig. 3 Variations of pH, ORP, and OD600 of mixed culture when the initial pH is 7.0

2.4 16S rRNA基因的DGGE分析

不同微生物的 16S rRNA基因序列中可變區的堿基順序有很大差異, 來自不同微生物的相同長度擴增片段能夠通過 DGGE得到分離, 根據電泳條帶的數量和條帶的強弱可以辨別出樣品中微生物的種類和優勢菌。發酵停止時, 利用PCR-DGGE測定在不同起始 pH培養條件中的混合菌群組成(圖4)。從經過銀染的DGGE凝膠圖中可以看出, 不同pH培養條件中都占優勢的條帶是 B1-B3所代表的菌屬。將條帶回收重新擴增進行序列測定, 結果見表1。通過NCBI-BLAST比對發現, 3條電泳帶所代表的菌株都與Clostridiumsp.存在高相似度。由此可見在不同起始 pH培養條件下混合菌群的優勢菌是相同, 屬于Clostridiumsp.。Valdez等[24]報道熱處理污泥富集的混合菌群組成只包括能產生芽孢的Clostridiumsp.和Bacillussp.。不能形成芽孢的非產氫菌和耗氫菌在熱休克處理中被殺死, 而能產生芽孢的產氫菌能夠得以成為優勢菌種。

圖4 不同起始 pH培養的混合菌群 16S rRNA基因的DGGE圖譜Fig. 4 DGGE profilesof 16S rRNA gene of the mixed culture under different initial pHs

表1 優勢菌16S rRNA基因DGGE圖譜條帶的比對結果Tab. 1 Affiliation of DGGE fragments determined by 16S rRNA sequence of dominant bacteria

2.5 Fe-氫酶基因的DGGE分析

不同起始 pH對混合菌的產氫量有比較明顯影響, 而16S rRNA基因的DGGE分離結果表明混合菌群的優勢菌基本相同。針對細菌的特定功能, 只是基于 16S rRNA基因序列分析混合菌群的多樣性這種方法明顯不足[25]。通過擴增功能基因, 利用 DGGE研究功能基因及功能菌群的多樣性[26]。Clostridiumsp.產氫過程主要是 Fe-氫酶催化完成。通過 DGGE分離梭菌 Fe-氫酶基因, 研究混合菌中 Fe-氫酶基因的多樣性。梭菌Fe-氫酶基因保守序列通用引物的擴增產物通過DGGE分離為特異性的單一條帶(圖5)。Fe-氫酶的DGGE圖譜條帶不存在多態性, 這表明在不同起始 pH培養條件下混合菌中參與產氫過程的Fe-氫酶基因是相同的。該片段序列與 NCBI數據庫中的相似序列進行 BLAST分析, 與Clostridium perfringens氫酶基因的相似度為 98%(登錄號GQ289376)。不同起始pH培養條件下混合菌群中是同一種梭菌參與混合產氫過程, 產氫梭菌初步確定為Clostridium perfringens。

圖5 不同起始 pH培養的混合菌群的 Fe-氫酶基因的DGGE圖譜Fig. 5 DGGE profiles of Fe-hydA gene of the mixed culture under different initial pHs

3 結論

起始pH對混合菌產氫量有比較明顯影響, 起始pH為 7.0時, 混合菌群產氫量最高。變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析不同pH培養條件下混合菌群組成?；旌暇?6S rRNA基因DGGE圖譜表明, 不同起始pH培養下混合菌群的優勢菌群組成基本相同?；旌暇旱腇e-氫酶基因的DGGE圖譜結果表明, 在不同起始pH培養條件下的混合菌群中, 參與產氫過程的Fe-氫酶基因相同, 與Clostridium perfringensFe-氫酶基因相似度是98%。不同起始pH條件下, 混合菌群的產氫菌是相同的, 起始pH對混合菌產氫量的影響也許與Fe-氫酶活性有關, 需進一步研究。

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The effect of initial pH on hydrogen production of microbial community from marine environment

LIU Hong-yan1,2, WANG Guang-ce2
(1. Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry, College of Marine Science and Engineering,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Oct., 25, 2010

initial pH; hydrogen production; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); 16S rRNA gene; Fe-hydrogenase gene

Sludge, collected from the intertidal zone of a bathing beach in Tianjin, was pretreated by the heat-shock method and enriched under anaerobic condition for hydrogen-production. Hydrogen production was investigated under various initial pHs , ranging from 4.0 to 8.0. The composition of microbial community under various initial pHs was analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The result showed that hydrogen production potential of the mixed culture was the highest at the optimal pH of 7.0. The effects of initial pHs on hydrogen production followed the order of pH 6.5＞ pH 7.5 ＞ pH 8.0 ＞ pH 6.0 ＞ pH 5.5 ＞ pH 5.0＞ pH 4.5 ＞ pH 4.0. The 16S rRNA gene was PCR amplified and analyzed by DGGE. The dominant bands obtained on DGGE of 16S rRNA gene were identical at various pH values. These bands were cloned and sequenced. NCBI blast indicated that the segment of 16S rRNA gene was identical to that ofClostridiumsp..There was only one band on DGGE of Fe-hydrogenase gene ofClostridiumsp.. The result of sequence similarity searching with NCBI BLAST indicated that the segment of Fe-hydrogenase gene was 98% identical to that ofClostridium perfringens. There existed identical hydrogen-producing bacterium of the mixed culture under various pHs. Initial pH could affect hydrogen production of the mixed culture through its influence on Fe-hydrogenase activity. This hypothesis needs further confirmation.

Q949.28+8.5

A

1000-3096(2011)09-0043-06

2010-10-25;

2011-03-25

國家自然科學基金項目(40906074); 天津市科技支撐計劃重點項目(07ZCGYSH03400); 天津市海洋資源與化學重點實驗室開放基金項目(200912)

劉洪艷(1977-), 女, 吉林通化人, 講師, 博士, 主要從事海洋微生物研究, 電話： 022-60601305, E-mail： hongyanliu1214@163.com;王廣策, 通信作者, 研究員, 電話： 0532-82898574, E-mail： guangcewang@sohu.com

康亦兼)