菌株B10對(duì)食用菌木霉病的拮抗作用及菌株鑒定

郝 捷,李 莉,陳 飛,李 楊,孫立梅,王 鶴,侯 靜,張海濤

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽(yáng) 110866;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧朝陽(yáng) 122000)

食用菌生產(chǎn)過(guò)程中,大多使用木質(zhì)素、纖維素含量較高的原料,木霉是發(fā)生最為普遍和危害嚴(yán)重的真菌病害之一[1-2],其對(duì)食用菌的侵染能力非常強(qiáng)[3]。由于大規(guī)模傳統(tǒng)生產(chǎn)多數(shù)使用常溫常壓滅菌,以及運(yùn)輸過(guò)程中菌袋被扎破等原因,使得食用菌發(fā)菌過(guò)程中容易受到木霉的侵染。在遼寧省朝陽(yáng)市召都巴鄉(xiāng)和鞍山市岫巖縣香菇發(fā)菌期間,出現(xiàn)的染菌袋中被木霉侵染的超過(guò)半數(shù),發(fā)菌期間不方便開(kāi)袋使用化學(xué)藥劑進(jìn)行殺滅,地栽期間出現(xiàn)的木霉雖然可以使用多菌靈等化學(xué)藥劑,但是木霉對(duì)其依然具有較強(qiáng)的抗性,農(nóng)藥殘留對(duì)食用菌的品質(zhì)也會(huì)有很大影響[4-5]。芽胞桿菌在動(dòng)植物生產(chǎn)種植的應(yīng)用已經(jīng)非常普遍[6-7],而在食用菌栽培生產(chǎn)中應(yīng)用研究較少,生物防治在食用菌產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用更顯突出。本試驗(yàn)將以實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的新菌株對(duì)致病菌木霉的生物防治展開(kāi)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 在食用菌實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)1株對(duì)栽培袋中的致病菌木霉具較強(qiáng)抑菌作用的菌株,經(jīng)挑取純化后命名為B10。木霉(Trichoder m a spp.)T101、T102、T104,本課題組從食用菌染菌的菌袋中分離;木霉29、74(保藏中心編號(hào)3.3029,3.2774),遼寧省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 儀器 高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K15型);T6-新銳可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司);外徑8 mm牛津杯;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 B10菌體與木霉的抑制作用 B10在NA培養(yǎng)基上32℃活化24 h,挑取1環(huán)于10 mL無(wú)菌水中,稀釋至10-3,吸取1 mL于PDA平板中,涂布均勻,32℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落,用8 mm打孔器打孔制成菌碟準(zhǔn)備待用。分別挑取木霉29、74、T101、T102、T104各1環(huán)于10 mL無(wú)菌水中,稀釋至10-3,吸取1 mL于PDA平板中,涂布均勻,26℃培養(yǎng)48 h,用8 mm打孔器打孔制成菌碟準(zhǔn)備待用。將打孔好的B10菌碟,分別與5種木霉接種PDA平板中,菌碟相距3 cm,3次重復(fù),放入恒溫培養(yǎng)箱中26℃培養(yǎng)72 h后測(cè)量抑菌圈大小和拮抗帶寬。拮抗帶寬按照下式計(jì)算：

式中,A為抑菌圈的最大直徑(mm),B為抑菌圈的最小直徑(mm),8為牛津杯的外徑(mm)。1.2.2 B10發(fā)酵液對(duì)木霉的拮抗作用[8-9]B10發(fā)酵液的制備：將B10接種于LB液體培養(yǎng)基中,32℃,170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液,按5%接種量轉(zhuǎn)接于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,32℃,170 r/min振蕩培養(yǎng),設(shè)置12、24、36、48、60、72 h 6個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段,然后8 000 r/min,4℃離心10 min,取上清液用0.45μm細(xì)菌濾器過(guò)濾,得到發(fā)酵上清液,存于冰箱,4℃保存?zhèn)溆?。發(fā)酵液拮抗實(shí)驗(yàn)用牛津杯法,將木霉29、74打孔后的菌碟分別接入培養(yǎng)皿距離中心1.5 cm左右位置,培養(yǎng)36 h,待木霉從菌碟上擴(kuò)散至PDA培養(yǎng)基上,并接近中心位置時(shí),將牛津杯微熱放在培養(yǎng)皿中,距離中心位置1.5 cm左右,與木霉菌碟平行,向牛津杯加入200μL發(fā)酵上清液,培養(yǎng)24 h后,再向牛津杯中加入200μL發(fā)酵上清液,以不接菌的LB培養(yǎng)基為對(duì)照,培養(yǎng)至木霉長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿,測(cè)發(fā)酵上清液抑菌圈大小。

1.2.3 發(fā)酵上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[10],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 B10的鑒定 B10生理生化實(shí)驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]使用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管測(cè)定。16S rDNA序列擴(kuò)增與測(cè)序,DNA提取參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[13]中基因組制備的方法,以引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)20 bp和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)19 bp進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性98℃5 min;循環(huán)95℃35 s,55℃35 s,72℃1 min 30 s,35個(gè)循環(huán),延伸8 min。經(jīng)切膠純化的PCR產(chǎn)物交由生物工程(上海)有限公司完成測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 B10對(duì)木霉抑制作用

如圖1所示,B10對(duì)木霉29、74、T101、T102、T104均有不同程度的抑制,拮抗線非常明顯,抑菌圈清晰。因T101與29,T102、T104與74菌落形態(tài)一致,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅選用木霉29和木霉74。經(jīng)測(cè)定,對(duì)木霉29、74的抑菌圈分別達(dá)到32.3、29.8 mm,拮抗帶寬分別是24.3、21.8 mm,拮抗效果明顯。

2.2 B10發(fā)酵液對(duì)木霉的拮抗作用

經(jīng)過(guò)6個(gè)時(shí)間段的培養(yǎng),通過(guò)細(xì)菌濾器獲得的發(fā)酵上清液對(duì)木霉29、74做拮抗實(shí)驗(yàn),以不接菌的LB培養(yǎng)基為對(duì)照組(CK),每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察,抑菌圈呈橢圓形,水平方向?yàn)樽畲笾睆?豎直方向?yàn)樽钚≈睆?取平均值,結(jié)果見(jiàn)表1。在6個(gè)時(shí)間段中,CK與12 h對(duì)木霉均沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的拮抗圈,拮抗現(xiàn)象不明顯,木霉可以緊貼牛津杯外緣生長(zhǎng)。36 h的發(fā)酵上清液對(duì)木霉29、74的拮抗效果最佳,拮抗帶寬最長(zhǎng),分別達(dá)到16.85、14.23 mm,且最大直徑與最小直徑相差不大,效果最為明顯,見(jiàn)圖2。

圖1 B10對(duì)木霉的菌體拮抗Fig.1 Antagonism of bacterium B10 on theTrichoder ma

表1 發(fā)酵上清液對(duì)木霉29、74的拮抗抑菌圈大小測(cè)定Table 1 Measurement of the size of inhibition zone ofTrichoder ma29 and 74 by the antagonism of abacterial fer mentation liquid

圖2 36 h發(fā)酵上清液對(duì)木霉的拮抗Fig.2 Antagonism of abacterial fer mentation liquid onTrichoder mafor 36 h

2.3 發(fā)酵上清液中蛋白質(zhì)含量

測(cè)得牛血清白蛋白的光密度OD595nm見(jiàn)表2,繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。通過(guò)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到6個(gè)時(shí)間段發(fā)酵上清液的蛋白質(zhì)含量,分別為0.158、0.307、0.441、0.573、0.466、0.549 mg/mL,如圖4所示,48 h發(fā)酵上清液蛋白質(zhì)含量最高,但36 h對(duì)木霉的拮抗效果最佳。

表2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Protein standard curve

圖3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Protein standard curve

圖4 發(fā)酵上清液蛋白質(zhì)含量Fig.4 The protein content in abacterial fermentation liquid

2.4 B10鑒定

圖5 B10革蘭染色顯微照片(1 000×)Fig.5 Micrograph of Gram stain of bacterium B10(1 000×)

菌株形態(tài)觀察：菌落圓形,邊緣粗糙,表面隆起、褶皺,乳黃色,菌落不透明,好氧,化能異養(yǎng),1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察,菌體呈桿狀,革蘭染色陽(yáng)性,如圖5。細(xì)菌快速生化反應(yīng)試驗(yàn)對(duì)B10菌的鑒定結(jié)果見(jiàn)表3,并參考文獻(xiàn)[14-15],可判斷B10菌為枯草芽胞桿菌(B acillus subtilis)或死谷芽胞桿菌(B acillus vallism ortis)。

表3 B10菌的主要生理學(xué)特性Table 3 Physiological characteristics of strain B10

菌株分子鑒定：16S rDNA序列測(cè)定片段長(zhǎng)度為1 420bp,序列提交GenBank,登錄號(hào)：JN112317,比對(duì)結(jié)果顯示該菌株序列與芽胞桿菌屬同源性最高,相似性大于99%,利用MEGA5的Maximum Likelihood進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,如圖6。與B acillus vallism ortisstrain EA6-11遺傳距離最近,置信度為90,結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA分子鑒定,確定為死谷芽胞桿菌(Bacillus vallism ortis)。

3 討 論

本試驗(yàn)所用的菌株,其菌體對(duì)食用菌栽培袋中的致病菌木霉拮抗效果比較明顯,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液具有較強(qiáng)拮抗作用,發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾等操作步驟,使得有效成分有所損失,需要加大劑量分2次加至400μL才能觀察到明顯的抑菌圈。發(fā)酵上清液具有拮抗作用與存在胞外分泌物有關(guān),通過(guò)蛋白質(zhì)含量測(cè)定,72 h與48 h蛋白質(zhì)含量相當(dāng),但拮抗效果不如36 h明顯,說(shuō)明36 h的有效成分較多。所以在后續(xù)研究中,使用36 h發(fā)酵液即可。

經(jīng)過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA分子鑒定,確定該菌株為死谷芽胞桿菌,它是一類較新的種。芽胞桿菌是較復(fù)雜的一個(gè)類群,除了較早定的Bacillus subtilis、B.am yloliquefaciens、B.licheniform is、B.pum ilus、B.atrophaeus等5個(gè)種外,陸續(xù)分化出B.vallism ortis、B.m ojavensis、B.tequilensis等新種[16]。死谷芽胞桿菌(B.vallism ortis)作為一新種,在應(yīng)用中還較少利用,本試驗(yàn)對(duì)木霉的拮抗效果非常明顯,將該菌制成菌劑在食用菌栽培過(guò)程中的應(yīng)用,還需深入研究。

圖6 以16S rDNA序列同源性為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on sequence homology of 16S rDNA

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