夜光蟲細胞發光光質檢測及來源分析

曹 恒 ，韓 晶，劉衛東 ，李桂娟，曹旭鵬

（1.中國科學院大連化學物理研究所海洋生物產品工程組，遼寧 大連116023；2.大連測控技術研究所，遼寧 大連116013；3.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023）

夜光蟲細胞發光光質檢測及來源分析

曹 恒1，韓 晶2，劉衛東3，李桂娟2，曹旭鵬1

（1.中國科學院大連化學物理研究所海洋生物產品工程組，遼寧 大連116023；2.大連測控技術研究所，遼寧 大連116013；3.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023）

夜光蟲（Noctiluca scintillans）是一類生活在海水中的原生動物，同時也是重要的赤潮生物，自20世紀90年代以來，赤潮的光譜遙感預報和監測就得到了關注，但是夜光蟲赤潮的光譜遙感準確度尚有不足。這主要是因為目前對夜光蟲自身發光光質的認識不足。因此希望在細胞水平上分析確認夜光蟲的熒光及其可能成因。在實驗室中對夜光蟲進行純培養，檢測前改變飼喂方法，已獲得具有不同體內食物顆粒的夜光蟲。利用倒置熒光顯微鏡、攝譜儀和時間分辨熒光光譜儀對單細胞水平上夜光蟲熒光進行檢測。夜光蟲具有光激發熒光（紅光）和相應刺激后的自發化學熒光（藍綠光）兩類熒光，其中光激發熒光與其吞噬的微藻色素熒光相同。夜光蟲發光主要包括以光輻照為基礎的光激發熒光和以物理刺激為基礎的化學熒光兩類，其中光激發熒光來源與夜光蟲捕食的藻類，而化學熒光是夜光蟲所特有的熒光。夜光蟲發光光質的研究，能夠為后續的遙感技術發展提供基礎生物學信息。

夜光蟲；熒光；生物發光；光質；遙感；赤潮

夜光蟲（Noctiluca scintillans），又被稱為夜光藻，是一類生活在水中的原生動物，在分類上隸屬于原生動物門（Protozoa）/甲藻門（Pyrrhophyta）、鞭毛蟲綱（Mastigophora）/甲藻綱（Dinofhyceae）、腰鞭毛目（Dinoflagellida）/裸甲藻目（Gymnodiniales），是近岸廣泛分布物種。也有人把Noctiluca scintillans稱為Noctiluca miliaris Suriray[1]。夜光蟲分布極廣，除寒帶海域外，幾乎遍及世界各海區，尤其是河口附近的數量更大，全年均可采集獲得[1-2]，同時也是最重要的赤潮生物之一，其赤潮發生頻率和范圍均相當高[3-4]。作為一種異養生物，夜光蟲沒有葉綠體，以吞噬其它生物或微小顆粒為生，如浮游植物（如四爿藻[3]）、藍藻、水蚤的卵、小的魚卵等[5]。

夜光蟲因其在夜間受海水波動刺激能發光得名，當大量夜光蟲由于海浪、魚群或者船舶擾動發光，海面星光萬點，似絢麗多彩的禮花，這一現象被稱為“?；稹?。在針對夜光蟲發光的科學研究方面，早在1810年，Surirary就報道了在英吉利海峽中夜光蟲的發光現象，在1917年Ethel Browne報道除了機械力刺激，電、化學、熱、震動的刺激都能引發夜光蟲產生熒光[6]。隨著顯微技術的發展，人們發現，夜光蟲受刺激時，細胞質中一種絲狀排列的發光顆粒能夠發出淡藍色熒光，其發光持續時間約100 ms[7]。此外，夜光蟲含有在紫外光激發下產生藍綠熒光的顆粒物質[7]。

近年來，隨著近岸海水富營養化的加劇，赤潮發生頻率和影響范圍日益嚴重，造成巨大的損失。作為主要的赤潮生物之一，夜光蟲赤潮的預報一直為人們所關注。目前光譜遙感技術的發展使得通過遙感技術預測和監測赤潮的發生成為可能。光譜遙感技術具有大面積、同步成像和相對廉價的優勢。目前遙感監測赤潮主要是依靠對葉綠素及其它附屬色素的檢測，表現在光譜曲線上即吸收峰位置、反射峰位置和吸收深度不同，已能夠成功的識別如丹麥細柱藻、紅色中縊蟲，但遺憾的是目前光譜遙感技術對夜光蟲識別精度不高[8]。

光譜遙感技術對夜光蟲識別精度不高的一個可能原因是對夜光蟲發光的特征了解不足。盡管對夜光蟲發光的研究已經超過100 a，但是已有研究主要集中在夜光蟲的發光機制上，關于夜光蟲發光光質等的介紹鮮有報道。本文將通過利用熒光顯微鏡、攝譜儀和熒光光譜儀對夜光蟲受激發光光質進行檢測，希望能夠為光譜遙感預報和檢測夜光蟲赤潮提供基礎生物學信息。

1 材料與方法

1.1 材料

通過浮游生物網在大連周邊海域采集水下10 m至表層的夜光蟲樣本，室溫條件下（23～25°C）靜置約 1 h，夜光蟲浮于表面。用玻璃吸管收集表層的夜光蟲，放入經過0.33 μm中空纖維超濾的天然海水中，分兩組在16°C進行培養，一組喂食亞心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis），其濃度為4×105cells/mL，每兩天投喂一次。對照組不喂食以消耗其自身的食物顆粒。

1.2 儀器

利用連接有數字圖像采集系統的尼康Eclipse TE2000U倒置熒光顯微鏡對夜光蟲不同激發波段下的熒光進行觀察，所使用的濾鏡為 UV-2A（330～380 nm），B-2A（450～490 nm）和 G-2A（510～560 nm）。

攝譜儀可以捕捉設定譜段內的各個波長的發光強度，但是對于夜光蟲這種微弱電光源捕捉的靈敏度和準確度不高，因此利用7IGF10定光柵攝譜儀 （北京賽凡光電儀器有限公司）對夜光蟲熒光全光譜進行捕捉，確定其發光的主要譜段。

在攝譜儀檢測結果的基礎上，利用FLS920時間分辨熒光光譜儀（Edinburgh Instruments,UK）的激發光掃描功能對鼓泡情況下夜光蟲受激發射熒光進行檢測。

1.3 試劑

實驗中使用的天然海水為大連10 m深處近岸海水，經沉淀、沙濾后使用0.33 μm中空纖維超濾系統（大連天邦）過濾除菌。

餌料四爿藻為實驗室自行培養，使用前通過離心去除培養基。

1.4 操作

1.4.1 熒光圖像采集

將10個喂食培養5 d的夜光蟲收集到1 mL海水中，平鋪在載玻片上，室溫條件下分別在可見、紫外、藍光和綠光4種光源下進行觀察，使用顯微鏡隨機附帶軟件以自動模式進行拍照。同時以不喂食四爿藻的夜光蟲作為對照。

1.4.2 物理刺激下夜光蟲發光光質測定

因為夜光蟲在水流、氣泡的影響下會產生藍綠光，因此這里對氣泡影響下的夜光蟲發光進行檢測。

在450～550 nm范圍內利用攝譜儀進行光質檢測，獲得夜光蟲自身受激發光的初步信息。將約30個夜光蟲收集到2 mL天然海水中，放入1 cm比色杯。將攝譜儀光纖探頭固定于比色杯口處，同時將輸液器針頭插入液面下方。用鋁箔紙將比色杯、針頭與探頭包裹形成避光環境。室溫條件下，向比色杯內鼓空氣刺激熒光產生，通氣速率量約20 mL/min。攝譜儀曝光時間10 s。

將約30個夜光蟲放入1 cm比色杯中，將注射器針頭插入液面下并通過輸液管引出熒光光譜儀，手動進行鼓泡，通氣速率量約20 mL/min空氣。熒光儀以5 nm/s的速度在450～550 nm范圍內對夜光蟲熒光進行掃描檢測。

獲得的光質數據導入OriginPro（version 8.1 SR3,Origin-Lab Corporation）進行分析、作圖。

2 結果與分析

2.1 熒光圖像分析

圖1 夜光蟲和其內部吞噬的微藻

保持喂食的夜光蟲在可見光下能清楚的看到細胞內部具有大量的食物，其中四爿藻的形態可以辨識（圖1）。

圖2 不同激發光條件下夜光蟲熒光

在不同激發光波長條件下，夜光蟲及其內部的四爿藻呈現出不同的熒光。由于夜光蟲自身運動影響，可見光與熒光圖中相對位置略有差異，但是不難看出，在不同激發光條件下，夜光蟲表面粘附及被吞噬在夜光蟲內部的四爿藻均呈現出紅色（圖2）。相比之下，對照組的夜光蟲內部只有少量紅色熒光（圖3）。

夜光蟲細胞質只有在紫外條件下有明顯的藍色熒光（圖2、圖3）。熒光來源于夜光蟲內部的顆粒狀物質，與文獻中報道[7]一致。

2.2 光質檢測結果

攝譜儀同時檢測整個待測波長范圍，可能因為并不適用于微弱電光源的檢測，檢測結果信噪比低，但是能夠看出在498 nm附近有最強的夜光蟲發光產生（圖4左上）。熒光光譜儀的檢測靈敏度高，在501 nm處有最高吸收，信噪高。但是熒光光譜儀屬于掃描型檢測，檢測波長可能與夜光蟲發光不同步，因此所獲得的檢測峰對稱性稍有欠缺（圖4）。結合這兩種檢測的結果，夜光蟲在物理刺激下發出的熒光應該在500 nm±5 nm。

3 討論

作為一種異養生物，正常狀態下夜光蟲自身細胞質內沒有色素或者色素很少，呈透明狀。但是當夜光蟲生長到一定的種群密度或者由于其它原因使其聚集則逐漸變為粉紅色，形成赤潮。因此，夜光蟲在赤潮形成之前，自身的顏色可能難以被用來進行光譜遙感預報。但是夜光蟲的兩個特點為我們進行相應檢測提供了可能。一種是夜光蟲由于吞噬食物顆粒的色素而具有顏色，另一種是夜光蟲自身受刺激后發光。

圖3 對照組未喂食夜光蟲紫外下的熒光照片

從本實驗中可以看出，由于夜光蟲大量進食四爿藻，未徹底消化的四爿藻體內的葉綠素等色素在紫外、藍、綠光激發下均呈現出紅色熒光，并且強度很高。從實際采樣過程中，也發現部分夜光蟲體內具有微藻等含有色素的食物顆粒，由于已有的光譜遙感工作中[8]，通常使用葉綠素熒光作為檢測譜段，因此在自然條件下這將導致難以區分夜光蟲為主的赤潮和夜光蟲餌料藻引發的赤潮。實驗中發現，夜光蟲自身受紫外激發會產生明亮的藍色熒光。這部分熒光應該具有很好的夜光蟲種屬特異性。在參考文獻[8]中也介紹400～585 nm段，光譜遙感數據對夜光蟲有較好的識別能力，只是結合了葉綠素熒光譜段后，發生錯誤的識別。

圖4 夜光蟲物理刺激下熒光光譜

因此，在基于日光的光譜檢測（激發、吸收、反射燈）之外，尋找夜光蟲特征性的檢測指標對于提高遙感識別夜光蟲具有重要的應用價值。本實驗通過利用攝譜儀和熒光光譜儀對夜光蟲自身作為應激反應的發光光質進行了檢測，發現夜光蟲自身受激發光為500 nm附近的藍綠光，不需要額外光源。僅管在實驗中觀察發現，無論白天黑夜夜光蟲都有熒光的產生，但是在白天受日光的影響，這部分熒光太過微弱難以有效的從背景中分離并進一步應用，在夜晚，由于外界光源減弱，有可能通過遙感技術對此進行檢測，并用以和其它光譜遙感數據相結合，作為預測和監測夜光蟲赤潮的一個指標，應該能夠提高光譜遙感檢測的準確性。

[1]杞桑，江天久.中國沿海的夜光蟲和夜光蟲赤潮概述[J].中山大學學報論叢，1995（3）：244-245.

[2]張天文，朱麗巖，徐培培，等.膠州灣夜光蟲豐度的季節變化和分布特征[J].中國海洋大學學報(自然科學版),2009，39(S1)：89-93.

[3] 吳玉霖，周成旭，張永山.夜光藻的室內培養[J].海洋與湖沼，1994，25（2）：165-167.

[4] 周成旭，吳玉霖，鄒景忠.夜光藻的營養動力學[J].海洋與湖沼，1994，25（2）：152-157.

[5]Balch W M，Haxo F T.Spectral properties of Noctiluca miliaris Suriray,a heterotrophic dinoflagellate [J].Journal of Plankton Research,1984,6(3)：515-525.

[6]Eckert R.Bioelectric control of bioluminescence in the dinoflagellate Noctiluca[J].Science,1965,147：1140-1145.

[7]Eckert R， Reynolds G T.The subcellular origin of Bioluminescence in Noctiluca miliaris [J].The journal of General Physiology,1967,50(5)：1429-1457.

[8]馬毅.赤潮航空高光譜遙感探測技術研究[D].青島：中國科學院海洋研究所，2003.

Detection and Characterization of Bioluminescence of Noctiluca Scintillans

CAO Heng1,HAN Jing2,LIU Wei-dong3,LI Gui-juan2,CAO Xu-peng1
(1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian Liaoning 116023,China;2.Dalian Scientific Test&Control Technology Institute,Dalian Liaoning 116013,China;3.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute,The Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province,Dalian Liaoning 116023,China)

Noctiluca scintillans is widely distributed throughout the world,occurring most often in coastal waters.N.scintillans is also a major source of red tide.Since 1990s,the forecast and monitoring of red tide by way of remote sensing has drawn more attention,but there is still problem in the precision of identifying N.scintillans.It is necessary to analyze the bioluminescence cause from the cell level.The method of cultivating N.scintillans in the lab to detect using fluorescence microscope,spectrograph meter and fluorescence spectrometer is adopted.There are two type of bioluminescence of N.scintillans,sunlight induced fluorescence derived from the preyed alga and chemi-luminescence induced by mechanical stimulation.It’s hoped to contribute some basic biology information for the further development of N.scintillans dominant red tide by remote sensing.

Noctiluca scintillans;fluorescence;bioluminescence;spectrum;remote-sensing;red-tide

Q89

A

1003-2029（2011）03-0009-04

2011-05-04

水下測控技術國防科技重點實驗室基金項目資助（9140C2603110905）

曹旭鵬(1978-)，男，副研究員，生物化工博士，研究主要包括海洋微藻資源利用，海洋微生物資源利用和生物酶催化。Email:c_x_p@dicp.ac.cn