細胞周期蛋白在喉癌組織中的表達及意義

劉馨蓮 殷 舞 李淑蓉 孫 靜

喉癌(laryngeal carcinoma)是頭頸部常見的惡性腫瘤，在我國該病約占全身腫瘤的1%～5%，列居9～16位，且近年來喉癌的發病率有著明顯上升的趨勢[1]。目前喉癌的病因仍不十分明確，可能與吸煙、飲酒、環境污染、病毒感染等因素有關。隨著對細胞周期調控認識的不斷深入，出現了“癌癥可能是一類細胞周期性疾病(cell disease)”的觀點。細胞分子生物學研究認為，腫瘤的本質在于細胞周期調控紊亂，細胞呈現失控性生長和凋亡減少[2]。體外研究發現，大多數細胞的細胞周期為10 ～48 h。主要分為4 期：G1期(DNA合成前期成期) 、S期(DNA合成期)、 G2期(DNA合成后期) 和M期(有絲分裂期)。細胞周期蛋白(Cyclins)作為細胞周期的正向調控因素，其異常表達是導致細胞周期調控機制受到破壞的主要原因之一，與惡性腫瘤發生發展密切相關[3]。本文采用免疫組化法，檢測Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E 4種蛋白產物在喉癌組織中的表達情況，旨在探討其與喉癌的發生、發展以及與臨床各病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2007年9月～2010年2月廣西壯族自治區人民醫院手術切除的喉癌組織標本67例。其中男性42例，女性25例，年齡33～73歲，平均(53.2±8.7)歲；高分化22例，中分化27例，低分化18例；有淋巴結轉移26例，無淋巴結轉移41例；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期24例。另取32例距癌灶邊緣0.5～1.0 cm的癌旁正常組織作為對照。全部病例均經病理檢查確診，且術前未行化療或放療，均有詳細的臨床病理資料、手術記錄。全部標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續切片。

1.2 試劑

鼠抗人Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin E單克隆抗體購自BD Pharmingen公司，S-P試劑盒購自北京中杉生物技術開發公司，DAB試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 方法

免疫組化染色采用 S-P法。石蠟切片脫蠟水化后，微波抗原修復，過氧化酶阻斷劑滅活內源性過氧化物酶活性，羊血清工作液封閉，滴加一抗4 ℃過夜，滴加生物素標記的二抗，滴加鏈親和素一過氧化物酶溶液，DAB顯色，蘇木精復染。以已知陽性組織切片作為陽性對照，用 PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷

Cyclin A、Cyclin E均以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，Cyclin D1、Cyclin B1以細胞核和細胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞。任意選擇5個高倍視野，每個視野至少含100個細胞，陽性細胞數≥10%為陽性，<10%為陰性，分別計算陽性率。

1.5 統計學方法

采用SPSS13.0軟件進行分析，應用t檢驗和χ2檢驗，以P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 Cyclin D1在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達

喉癌組織中Cyclin D1表達陽性率為64.2%(43/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[15.6%(5/32)]，有統計學差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。Cyclin D1高表達與腫瘤有無淋巴結轉移有關(表1) (P<0.05)，但經統計學分析發現，Cyclin D1高表達與患者性別及臨床分期無關(表1)。

2.2 Cyclin A在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達

喉癌組織中Cyclin A表達陽性率為59.7%(40/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[9.4%(3/32)]，有統計學差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。CyclinA高表達與腫瘤有無淋巴結轉移相關(表1) (P<0.05)，但經統計學分析發現，CyclinA高表達與患者性別及臨床分期無關(表1)。

2.3 Cyclin B1在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達

喉癌組織中Cyclin B1表達陽性率為71.6%(48/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[12.5%(4/32)]，有統計學差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。Cyclin B1高表達與腫瘤有無淋巴結轉移相關(表1) (P<0.05)，但經統計學分析發現，Cyclin B1高表達與患者性別及臨床分期無關(表1)。

2.4 Cyclin E在癌旁正常組織和喉癌組織中的表達

喉癌組織中Cyclin E表達陽性率為62.7%(42/67)，明顯高于正常喉黏膜組織[9.45%(3/32)]，有統計學差異(P<0.05)。隨著喉癌組織分化程度下降，其陽性率逐漸增高(表1) (P<0.05)。Cyclin E高表達與腫瘤有無淋巴結轉移相關(表1) (P<0.05)，但經統計學分析發現，Cyclin E高表達與患者性別及臨床分期無關(表1)。

表1 Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E表達及與喉癌臨床病理特征的關系(例，%)

3 討論

腫瘤的發生是多步驟、多因子參與的過程。近年來，分子腫瘤學研究表明，細胞周期調節失控在惡性腫瘤發生中起著關鍵作用，細胞周期的進程主要依靠細胞周期蛋白 (Cyclins)，細胞周期素依賴激酶( cyclin dependent kinase,CDK )和細胞周期素依賴激酶抑制劑 (cyclin dependent kinase inhibitor,CKI) 三者的形成、激活及相互作用進行調節。其中，Cyclins是正向調控CDK活性的關鍵蛋白，其有規律的時相性表達是驅動細胞周期正常運行的必要條件。Cyclins異常表達可破壞細胞周期的調控平衡，是導致細胞失控性生長、惡性轉化的重要因素；反過來，Cyclins的表達狀況也可以反映細胞周期的正常與否、腫瘤的進展狀態及歸宿。在人類腫瘤細胞中，已經發現多種細胞周期蛋白的異常表達。近年研究表明，細胞周期蛋白在腫瘤發生、發展中起重要作用，對判斷腫瘤的生物學特征、預后、指導臨床治療有重要的意義。

Cyclin D1是細胞周期蛋白家族中的重要一員它與相應的CDK結合，形成 Cyclin-CDK復合物，導致CDK激酶活化，使細胞分裂由G1期進入S期[4]。在細胞周期中，G1/S期調控點是細胞內外信號經過傳遞、整合匯集到細胞核，對細胞增殖進行調控的關鍵點，該點調控的異常與腫瘤的發生發展關系密切[5]。Cyclin D1是G1/S轉換的正性調控因子[6]，當Cyclin D1擴增或過表達時，G1/S期縮短，促使細胞增殖，導致癌變。本研究結果顯示Cyclin D1在癌旁正常組織中低表達，在喉癌組織中Cyclin D1高表達，且其表達水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，說明喉癌組織中Cyclin D1的表達是存在的，并且在喉癌的發生發展過程中起重要作用，與腫瘤的惡性程度密切相關。

Cyclin A在G1期表達呈陰性或表達水平極低，隨S期的進展而升高，在G2/M期的表達達到高峰。Cyclin A在G1/S和G2/M轉換中均發揮重要作用[7]，既是G1向S期限速步驟，也促進G2期向M期轉換。Cyclin A與CDK2 結合使其活化，活化的CDK2 又磷酸化一系列底物，從而對DNA 合成與有絲分裂等進行調控。研究表明，Cyclin A 表達異常可使細胞周期發生改變，與多種腫瘤的形成、進展狀態及預后等相關[8]。本研究結果顯示，Cyclin A在癌旁正常組織中低表達，在喉癌組織中Cyclin A高表達，且其表達水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，提示隨著腫瘤級別的增加，有越來越多的細胞增殖活躍。

Cyclin B1 是控制細胞進入G2/M期的關鍵因子，它與CDK1 的結合是M期事件啟動和進行的必要條件，它最早出現于G1期，主要合成于S/G2期，在G2/M期表達最高，有絲分裂結束后迅速被泛素化降解(ubiquitination)[9，10]。Cyclin B1與CDK1結合后形成CDK1/ Cyclin B1 激酶復合物，催化一系列底物的磷酸化，從而使細胞進入有絲分裂期[11]。Cyclin B1是所有細胞周期素中惟一一個隨細胞周期改變而發生位置轉移的細胞周期素，在細胞有絲分裂間期，Cyclin B1分布于細胞質中，但到有絲分裂開始時，在核膜斷裂之前，快速轉位到細胞核中。本研究結果顯示Cyclin B1在在癌旁正常組織中低表達，在喉癌組織中Cyclin B1高表達，且其表達水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，提示Cyclin B1的過表達可使進入G2/M期的細胞百分比增加，從而影響細胞周期的進程，促進細胞增殖。

Cyclin E是1種從釀酒酵母菌中提取出來核蛋白[12]，細胞周期分子生物學研究表明，Cyclin E表達升高始于G1中期，至G1晚期的G1/ S轉換點達到高峰，而后隨細胞進入S期，Cyclin E開始下降，到G2/ M 期降為零，Cyclin E是細胞從G1期向S期轉換的主要限速因素之一。Cyclin E與細胞周期素依賴激酶2( CDK2) 結合在細胞周期G1/S晚期起作用。其過度表達能加速G1/S轉化，縮短G1期進程，導致細胞提前進入S期，干擾DNA、中心體復制和分裂，導致基因不穩定并可能出現染色體不均等分裂和非整倍體等核型異常，進而引起細胞的轉化和腫瘤生成[13～15]。本研究結果顯示，Cyclin E在在癌旁正常組織中低表達，在喉癌組織中Cyclin E高表達，且其表達水平隨著腫瘤分化程度降低而升高，說明在喉癌組織中存在Cyclin E高表達，表明處于分裂增生狀態的Cyclin E表達增強，激活CDKs，促進細胞進入S期，無限增生而導致癌癥發生。

綜上所述，Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E蛋白表達在喉癌的不同級別和淋巴結轉移方面具有差異，為判斷喉癌細胞的增殖活性提供了依據，說明Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和Cyclin E的表達喉癌的發生、發展過程中起重要作用，是判斷喉癌惡性程度的重要參考指標，可輔助常規病理診斷并為判斷預后提供信息。

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