乳腺良惡性組織中UNC5B及VEGF的表達及相關性

向 芳 金 霞 殷先利 劉振洋 李 勇

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，每年約有30%以上的患者死于復發或轉移，而血道和淋巴道轉移是導致治療失敗的最常見原因。研究表明腫瘤的侵襲與轉移同樣伴隨著新生血管形成。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是最重要的細胞因子之一,是特異性的血管內皮細胞促有絲分裂劑。研究發現[1]VEGF及其受體參與了腫瘤新生血管的形成，同時也是腫瘤抗血管治療的靶點。最近的研究表明[2]，多種腫瘤都高表達VEGF，正常組織極少表達，而且腫瘤組織VEGF的表達水平與腫瘤復發、轉移及預后密切相關。Park研究了神經生長因子Netrin-1及其受體UNC5B在新生血管軸突導向過程中的作用[3]，發現細胞表面受體UNC5B可以引導血管發育，UNC5B基因缺陷可以誘導血管內皮細胞的延伸，從而引起血管分支增加。

我們采用免疫組化的方法檢測UNC5B和VEGF在乳腺癌和乳腺良性病變組織中的表達，分析UNC5B和VEGF表達與乳腺癌臨床病理因素之間的關系及兩者之間的相關性；再結合對患者的隨訪結果，采用Spearman相關性分析UNC5B在乳腺癌中的表達及意義，判斷UNC5B對乳腺癌患者生存期的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

43例乳腺癌組織和20例乳腺良性病變組織石蠟標本均來自湖南省腫瘤醫院2003年6月至2004年6月接受乳腺腫瘤切除的患者，乳腺癌患者平均年齡48.74歲,乳腺良性腫瘤患者平均年齡41.8歲。乳腺癌患者中21例為浸潤性導管癌，22例為浸潤性小葉癌；良性病變中7例纖維囊性乳腺病，6例乳腺腺病，7例纖維腺瘤。乳腺癌分期按2002年出版的《美國癌癥聯合委員會(AJCC)癌癥分期手冊》第6版的病理學TNM分期標準[4]進行確定：Ⅰ期3例，Ⅱa期15例，Ⅱb期10例，Ⅲa期12例，Ⅲc期3例。

1.2 試劑

兔抗人UNC5B單克隆抗體濃縮型、超敏鏈霉素抗生物素-過氧化物酶(Streptavidin-peroxidase SP)免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。兔抗人VEGF多克隆抗體購自福州邁新公司。工作液。PBS緩沖液和檸檬酸修復液由湖南省腫瘤醫院病理科配制。

1.3 實驗方法

全部標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續4 μm切片，常規HE染色。按照S-P免疫組化染色試劑盒說明書所示步驟進行UNC5B及VEGF染色。陰性對照：用已知陽性乳腺癌切片，以兔血清封閉液和同種屬非免疫血清作空白對照，結果陰性。

1.4 結果判定

所有結果均由高年資病理科醫生單獨閱片。高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數100 個腫瘤細胞，共計數1000 個細胞。陽性判斷采用半定量標準[5]：①按染色強度計分“0”分為無色，“1” 分為淡棕黃色，“2”分為棕黃色，“3”分為紅褐色；②按陽性染色細胞百分率計分：0分為陽性細胞數≤10%；1 分為陽性細胞數≤25 %；2 分為陽性細胞數≤50%；3 分為陽性細胞數>50%。然后將兩類計分結果的乘積分為以下等級：0 分為(-)，1 ～ 2 分為(+)，3～4分為(++)，5分以上為(+++)。根據Mattern的判定標準，表達程度的劃分界限是：陰性為(-)～(+)，陽性為(++)～(+++)。

1.5 統計學處理

用SPSS 17.0 Windows統計軟件進行分析處理，計量資料以均數±標準差表示；計數資料采用χ2檢驗；采用Spearman相關性分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 UNC5B及VEGF在乳腺腫瘤組織中表達的特點

2.1.1 UNC5B在乳腺腫瘤組織中表達的情況 UNC5B主要表達在腫瘤細胞胞質、胞膜中，呈棕黃至深棕色，邊界清楚，無明顯背景著色；UNC5B在20例良性乳腺腫瘤組織中均為強陽性表達。而在乳腺癌組織中的表達部分有下降，43例乳腺癌患者中陽性者24例(55.8%)，陰性者19例(44.2%)，惡性腫瘤組織中UNC5B表達明顯低于良性腫瘤組織(χ2=12.653,P=0.0004)(見表1)。

2.1.2 VEGF在乳腺腫瘤組織中表達的情況 VEGF陽性表達主要位于腫瘤細胞胞質內，呈棕黃至深棕色,邊界清楚。VEGF在20例乳腺良性組織中陽性率為10.0%(2/20)。VEGF在乳腺癌中的陽性表達率為65.1%(28/43)。VEGF在乳腺癌中的陽性表達率明顯高于乳腺良性病變，兩者之間有顯著差異(χ2=16.625,P=0.0001)(見表1)。

表1 乳腺腫瘤UNC5B及VEGF表達情況(例，%)

2.2 UNC5B及VEGF的表達與乳腺癌臨床病理因素間關系

UNC5B的表達與患者年齡、腫塊大小、受體情況、臨床分期、淋巴結轉移數目及病理類型無關(P>0.05)。VEGF的表達與患者年齡、腫塊大小、受體情況、臨床分期及病理類型無關(P>0.05)；但與淋巴結轉移情況相關。有淋巴結轉移的VEGF陽性率表達較高，為91.7%；沒有淋巴結轉移的VEGF陽性率為37.5%，兩者之間差異具有顯著性(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌UNC5B及VEGF的表達與臨床病理關系

2.3 UNC5B及VEGF的表達與乳腺癌患者預后的關系

43例乳腺癌患者術后臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，均未接受術前放化療。經手術切除后均接受不同程度的放化療及內分泌治療，至2009年12月，43例患者均接受了6年以上隨訪。對43位乳腺癌患者的無病生存時間與UNC5B的表達情況進行Spearman分析后發現兩者呈正相關(γ=0.307，P=0.045)，見表3。同樣對43位乳腺癌患者的無病生存時間與VEGF的表達情況進行Spearman分析后發現兩者呈負相關(γ=-0.456，P=0.002)，見表3。

表3 乳腺癌患者UNC5B及VEGF表達與無病生存期的相關性(例,%)

2.4 乳腺癌組織中UNC5B及VEGF表達之間的關系

采用直線相關分析，UNC5B與VEGF的表達呈負相關，相關系數γ=-0.342，P=0.019,見表4。

表4 乳腺癌中UNC5B及VEGF的表達的相關性(例)

3 討論

形成新的血管是乳腺癌生長和轉移的生物學基礎。UNC5B作為1種神經生長因子(Netrin)受體，在引導血管生成上起到關鍵作用。

法國法蘭西學院Anne Eichmann研究小組日前研究發現[6]，只有在蛋白受體UNC5B存在時，Netrin -1蛋白才能起到收縮內皮突起細胞絲狀偽足的作用。當UNC5B受體遇到1個名為Netrin的分子時，就會發出信號阻止新生血管生長，使之不能過度延伸。該研究表明，血管內皮細胞中的UNC5B作為排斥Netrin蛋白的受體調控了血管系統的形態發育[7]。國內有研究顯示UNC5B基因在HCC(肝細胞癌)組織血管內皮細胞及活化后的HUAEC(人臍動脈血管內皮細胞)中的表達均明顯下調，提示UNC5B的表達下調可能與HCC的血管生成相關[8]。

破壞UNC5B可以誘導血管分叉，從而導致血管系統的錯誤導航，可以推測其與腫瘤的擴散轉移有一定關聯。我們研究發現UNC5B表達缺失的患者預后較差，其無病生存期也低于UNC5B陽性的乳腺癌患者，這是否意味著腫瘤血管在生成過程中由于缺乏UNC5B的導航，導致血管過度分叉，最終導致轉移和復發？在本研究中，UNC5B表達與腫塊大小，淋巴結轉移數目和受體情況無明顯相關性，與年齡，病理類型也無明顯相關性。但在隨訪中發現，UNC5B表達缺失的患者的5年生存期明顯低于UNC5B表達陽性的。這提示UNC5B表達缺失可能與乳腺癌患者的預后相關。但是由于我們研究的標本數量較少，UNC5B對患者預后的影響還有待進一步大樣本的研究。

UNC5B在為數眾多的腫瘤中表達缺失，相應的在這些腫瘤中由UNC5B介導的細胞凋亡通路也失活，從而導致細胞在細胞外脅迫壓力下發生惡變。本研究發現乳腺惡性腫瘤UNC5B的表達與乳腺良性腫瘤有顯著差別(表達缺失率44.18%，P<0.05)。這說明UNC5B基因表達缺失的確與乳腺癌的發生有一定關聯。這與Thiebault等[9]的研究是一致的。我們可以推測UNC5B基因可能通過誘導細胞凋亡而對腫瘤生長起到負性調控作用。

VEGF是目前已知的最重要的促血管內皮生長因子之一。VEGF又稱血管內皮生長因子，正常情況下，VEGF在人體許多正常組織中表達水平極低，而大多數惡性腫瘤存在VEGF高表達[10]。

我們在對43例乳腺癌組織和20例乳腺良性病變組織的VEGF表達進行了研究，發現VEGF在乳腺良性組織中陽性表達率僅10%，而乳腺癌組織中陽性表達率高達65.12%，兩者之間有顯著差異。說明VEGF過表達與腫瘤的發生及生長密切相關,目前研究認為腫瘤細胞和血管組成1個高度整合的生態系統，源于腫瘤細胞或相關炎性細胞的彌散信號促使內皮細胞從休克狀態變為快速增殖狀態[11]。

新生血管形成之后，腫瘤灶局部快速播散，增強腫瘤灶的遠處轉移能力[12]。我們研究發現VEGF表達陰性的預后較好，表達陽性預后較差，這一結果提示VEGF不僅參與了腫瘤的血管生成，還與腫瘤的轉移和擴散密切相關。這與國內外研究結果是一致的[13，14]。

進一步研究發現有淋巴結轉移者VEGF表達率較無淋巴結轉移者高，統計學分析其差異具有顯著性(P<0.05)。表明VEGF可以促進癌細胞通過血管-淋巴管連接進入淋巴循環發生轉移，它還能促進基膜降解，有利于癌細胞遷移[15，16]。而乳腺癌組織中VEGF表達與腫塊大小、患者年齡、病理類型及受體情況無關。這與國內外相關報道的結果是一致的[17]。

在本研究中我們對乳腺癌組織中的UNC5B及VEGF表達情況進行研究發現:VEGF表達與UNC5B呈負相關(P<0.05)。這說明：乳腺癌組織中UNC5B表達缺失導致血管異常導航，血管分支增加，從而導致血管密度增加和血管形態改變；而腫瘤組織中大量新生的血管需要血管內皮生長因子的誘導，故VEGF的表達上調。

因此同時阻斷腫瘤組織中VEGF的表達和提高腫瘤組織中UNC5B的表達將在腫瘤的治療中具有廣闊前景。

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