18F-FLT檢測非小細胞肺癌對特羅凱敏感性的研究

楊伯平 侯茹蓉 任瑞美

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)自分泌途徑是癌癥發生發展的重要影響因素，針對EGFR的靶向藥物已顯示出良好的臨床療效。但Haddad等[1]發現，盡管EGFR在大多數肺鱗狀細胞癌中都呈過表達，只有少數患者能從EGFR靶向治療中獲益。有研究顯示，上皮型的肺癌對EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治療較發生了間質化改變的上皮細胞敏感，提示肺癌的上皮細胞間質轉換 (epithelial mesenchymal transition,EMT)狀態有望成為靶向治療療效的預測因素[2，3]。上皮細胞-間質轉化是上皮細胞在與周圍間質的相互作用過程中逐漸獲得了某些間質細胞特有性狀的現象，腫瘤細胞也因此獲得較強的侵襲和移動能力。 EMT 不僅包括細胞形態學的改變，還包括其基因型的改變，腫瘤細胞的代謝活性也因此發生了改變。本實驗構建Snail擴增載體，并轉染SPCA-1細胞，觀察細胞發生EMT的改變，并在細胞水平上，研究非小細胞肺癌發生EMT前后3-脫氧-3-18F-氟代胸苷 (3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine,18F-FLT)的標準攝取值(standardized uptake value,SUV)的改變，對特羅凱敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

SPCA-1細胞株由本實驗室保存，用含15%血清的DMEM中培養細胞，條件為5%CO2，溫度為37℃，每2～3天傳代1次。

1.2 pcDNA-Snai的構建及轉染提取人白細胞總RNA

采用RT-PCR方法擴增Snail基因全長，上下游引物為Forward primer：5'-aaagagcgcggcatagtgg-3'；Reverse primer：5'-tgctcaggatgtccccgctga-3'，在上下游引物中分別加入BamH I和Xba I位點。將克隆產物連接到pcDNA3.1(+)上，構建成pcDNA-Snail。采用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1轉染SPCA-1細胞株，并采用G 418進行篩選培養。

1.3 Western-blot 檢測轉染了pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1的SPCA-1細胞株中snail基因表達

倒去6個孔板中的培養液，用PBS液沖洗2次，然后將200 μl細胞裂解液加入孔中(150 mM NaCl,50 mM Tris HCl,2 mM EDTA,0.5% Triton-X100,5mM DTT,0.2 mM PMSF H2O,Aprotinin)，20 min后收集，然后在4℃下13 000轉離心10 min，吸取上清液，沸水浴加熱上清液樣品變性3 min，制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠，并點樣于膠中電泳1.5 h，在電轉膜儀上將凝膠中的樣品轉移到硝酸纖維素濾膜上2 h左右，將硝酸纖維素濾膜于封閉液中4℃冰箱孵育過夜；將膜卷曲置于離心管中，PBS沖洗，在抗snail鼠單抗中共育30 min，TBS-T漂洗5 min 3次，用第二抗羊抗鼠抗體IgG溫育半小時，加入DAB顯色劑至陽性條帶顯色理想為止，在EDTA 緩沖液中終止顯色反應。

1.4 免疫組化法檢測SPCA-1細胞株中E-cadherin、vimentin、EGFR的表達

將轉染1周后的細胞株與對照組SPCA-1細胞株接種于涂有多聚賴氨酸的玻片上，貼壁后，取出玻片，用預冷的丙酮固定細胞5 min，PBS沖洗3次，0.01%胰酶消化3 min，加入稀釋的一抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入二抗孵育30 min，PBS沖洗3次加入三抗孵育30 min，PBS沖洗3次后DAB顯色。計數1 000個肺癌細胞中陽性細胞數,無陽性細胞為陰性(-)；陽性細胞數<1%為“+”；1%～10%為“++”；11%～50%為“+++”；>50%為“++++”[8]。

1.5 檢測SPCA-1細胞株中18F-FLT的攝取值

2個6孔板3 復孔，在2組細胞株中加入74 KBq的18F-FLT,并設標準源，在培養箱中培養1 h。取出后置于冰上，快速取各孔的上清液分別滴入編號的試管中，用冷凍過的磷酸鹽緩沖液沖洗各孔，將沖洗液混入原孔的上清液中。收集各孔的細胞分別放入編號的試管中，與其上清液相對應，應用γ-counting well(SY-2021定標器)計數細胞內(cell in,Cin)和細胞外(cell out,Cout)的放射性[2],計算Cin和Cout的比值(Cin/Cout)，進行3次獨立實驗，采用臺盼藍拒染法檢測活性細胞數。

1.6 MTT法檢測erlotinib對細胞株的生長抑制作用

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 表達載體pcDNA3.1- snail質粒(圖1)

2.2 Wenstern-bloting 檢測結果

轉染了pcDNA3.1- snail和空pcDNA3.1的SPCA-1細胞株中snail基因表達見圖2。

圖2 Western blot檢測結果

2.3 免疫組化結果

E-cadherin陽性細胞為細胞膜呈棕黃色染色，vimentin陽性細胞為胞質呈棕黃色染色，EGFR陽性細胞為胞質呈片狀或顆粒狀棕黃色染色,實驗組細胞株中E-cadherin表達水平較對照組下降，vimentin表達水平較對照組下降,均有統計學差異,EGFR表達水平無明顯變化。

2.4 實驗組和對照組細胞株18F-FLT的攝取值

實驗組和對照組細胞株內加入74 KBq的18F-FLT,并設標準源，3個復孔，在培養箱中培養1 h。實驗組細胞株的攝取值[( 4.8±0.5)%]，高于對照組細胞株[(2.3±0.5)%]，有統計學差異，P=0.003。

2.5 MTT法檢測erlotinib對實驗組和對照組細胞株的生長抑制作用

實驗組細胞株抑制率為(20.6%±3%)，明顯低于對照組細胞株(50%±2%)，P=0.008。

3 討論

目前在多種實體瘤如乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腦腫瘤中均發現EGFR過表達。Haddad等[1]研究也發現，盡管EGFR在大多數頭頸部鱗狀細胞癌中都有過表達，但只有少數患者能從EGFR抗體治療中獲益。

另有研究發現對特羅凱(erlotinib)敏感的細胞E-cadherin具有較高的表達水平，且浸潤和轉移能力較低，相反對erlotinib抗拒的細胞，E-cadherin表達水平低，且浸潤和轉移能力強，因此，E-cadherin有可能成為判斷EGFR活性和靶向EGFR藥物治療療效的生物學指標之一[3]。Fuchs等[4]根據E-cadherin和Vimentin的表達不同將12種細胞株分為上皮型和間質型，研究發現上皮型細胞對靶向EGFR的治療各種藥物均敏感，而間質型往往表現為抗拒且易發生浸潤和轉移。

EMT的概念改變了上皮細胞一成不變的觀念，認為上皮細胞是一群具有高度可塑性的細胞。而調控上皮細胞進行EMT的動力，主要是來自于與上皮細胞有密切交互作用的細胞黏附分子，其中以鈣黏蛋白(E-cadherin)一類的細胞黏附分子的調控最為重要。Eastham等[5]以干細胞為研究對象，結果發現，人類胚胎干細胞的分化程度主要決定于E-cadherin和N-cadherin的轉變，增加vimentin 表達，上調E-cadherin抑制分子，細胞會出現運動，如果用抗體破壞介導干細胞之間互相連接的E-cadherin，細胞也會出現移動，細胞之間的有序結構消失出現間質變的現象。Lang等[6]認為vimentin表達參與調控上皮細胞的運動,在需要細胞移動的生理(如修復)及病理過程(如腫瘤轉移)中上皮細胞往往表達vimentin 。Rho等[7]用腫瘤生長因子(TGF-beta1)作用肺鱗癌細胞株(A549)72h后出現EMT的改變，而去掉TGF-beta1后細胞回到以前的狀態。另有研究發現對特羅凱敏感的細胞E-cadherin具有較高的表達水平，且浸潤和轉移能力較低，相反對特羅凱抗拒的細胞，E-cadherin表達水平低，且浸潤和轉移能力強，因此，EMT是細胞的1種狀態，如有非創性的手段發現細胞組織處的狀態，將對指導靶向EGFR藥物治療提供理論依據。

Kudo-Saito等[8]研究發現Snail基因是調控EMT的主要基因。本研究發現，擴增Snail后，E-cadherin表達降低，vimentin表達升高，即細胞發生EMT改變。同時細胞的形態發生了改變，細胞變得細長，細胞融合度降低，并且MTT法結果顯示細胞對特羅凱的敏感性降低。在體內病變的組織器官出現結構變化之前，18F-脫氧葡萄糖正電子發射斷層顯像術(18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography,18F-FDG- PET)可從分子水平檢測和識別所發生的代謝改變。用PET檢查腫瘤的代謝，已有很多報道，18F-FLT被認為是反映腫瘤細胞增殖的1種新型示蹤劑，Atkinson 等[9]結果顯示，erlotinib應用3天后，SUV下降18%，安慰劑組下降1%。在鱗狀細胞移植瘤檢測西妥昔單抗(cetuximab)的療效，cetuximab應用后1周，SUV下降62%，安慰劑組下降16%。因此認為，18F-FLT-PET可以早期檢測腫瘤對靶向EGFR治療的反應。本研究結果也顯示，細胞發生EMT改變后，對18F-FLT的攝取增加。

本研究從細胞水平，探討了E-cadherin、vimentin、EGFR表達的變化和18F-FLT的SUV等指標與腫瘤對erlotinib的敏感性的關系，為應用功能影像進行非小細胞肺癌靶向治療的個體化選擇提供理論基礎,以指導臨床應用。

[1]Haddad Y,Choi W,McConkey DJ.Delta-crystallin enhancer binding factor 1 controls the epithelial to mesenchymal transition phenotype and resistance to the epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in human head and neck squamous cell carcinoma lines〔J〕.Clin Cancer Res，2009,15(2):532.

[2]Thomson S,Buck E,Petti F,et al.Epithelial to mesenchymal transition is a determinant of sensitivity of non-small-cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition〔J〕.Cancer Res,2005,65(20):9455.

[3]Yauch RL,Januario T,Eberhard DA,et al.Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res,2005,11(24):8686.

[4]Fuchs BC,Fujii T,Dorfman JD,et al.Epithelial-to-mesench-ymal transition and integrin-linked kinase mediate sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibition in human hepatoma cells〔J〕.Cancer Res,2008,68(7):2391.

[5]Eastham AM,Spencer H,Soncin F,et al.Epithelial-mesenchymal transition events during human embryonic stem cell differentiation〔J〕.Cancer Res,2007,67(23):11254.

[6]Lang SH,Hyde C,Reid IN,et al.Enhanced expression of vimentin in motile prostatecell lines and in poorly differentiated and metastatic prostate carcinoma〔J〕.Prostate,2002，52：253

[7]Rho JK,Choi YJ,Lee JK,et al.Epithelial to mesenchymal transition derived from repeated exposure to gefitinib determines the sensitivity to EGFR inhibitors in A549,a non-small cell lung cancer cell line〔J〕.Lung Cancer,2009,63(2):219.

[8]Kudo-Saito C,Shirako H,Takeuchi T,et al.Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells〔J〕.Cancer Cell,2009，15(3):195.

[9]Atkinson DM,Clarke MJ,Mladek AC,et al.Using fluorodeoxythymidine to monitor anti-EGFR inhibitor therapy in squamous cell carcinoma xenografts〔J〕.Head and Neck，2008,30(6):790.