SiRNA逆轉T24/ADM細胞耐藥性的研究

陳從波 姚啟盛 王曉康 楊 勇 劉正清

有研究表明，在膀胱癌的多藥耐藥產生機制中，多藥耐藥基因(multidrug resistance gene，MDR1)編碼的糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的過度表達是腫瘤細胞產生耐藥的分子基礎。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是1種有效抑制基因表達的技術，能夠特異而有效地引起轉錄后基因沉默在mRNA水平關閉相應基因的表達，具有穩定、特異、低毒以及作用持久等特點。本研究設計以人膀胱癌細胞系/阿霉素(T24/ADM)細胞株MDR1基因為靶標的小干擾RNA，觀察其對MDR1基因表達及細胞株耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及器材

人膀胱癌細胞株T24購于武漢大學中國典型培養物保藏中心。阿霉素(adriamycin，ADM)(深圳益飛醫藥化工有限公司)，RPMI 1640培養液(美國GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亞砜(DMSO,SIGMA公司)，酶聯免疫檢測儀(BIO-RAD550，美國伯樂公司)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，PCR儀(美國BD公司)。

1.2 siRNA的設計與合成

根據GeneBank mdr1基因已知序列(基因編號NM000927)按siRNA序列設計的原則，從轉錄本mRNA的AUG起始密碼開始，選取3條含21個堿基的序列，由上海生化工程公司合成其正義和反義單鏈，最后用SilenceTM siRNA Construction Kit(Ambion 公司)試劑盒體外轉錄正義和反義單鏈成雙鏈siRNA，設隨機序列作為陰性對照(si-neg)。SiRNA的序列如下：5′ GAGCUUAACACCCGACUUAUU3′,5′GAAAGUAUACCUCCAGUUUUU 3′,5′GAC CAUAAAUGUAAGGUUUUU3′。

1.3 細胞培養及轉染

T24細胞在RPMI 1640完全培養基中培養(10%小牛血清)，于37℃、5% CO2的培養箱中培養。采用ADM濃度梯度遞增誘導法，直至細胞能在含1.0 mg/L 阿霉素的培養基中維持生長，并能穩定傳代30代以上，即成為耐藥人膀胱癌細胞模型T24/ADM，耐藥細胞在含0.1 mg/L ADM的培養液中培養。實驗前無藥培養兩周。參照文獻[1]，用Oligofectamine 轉染試劑(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)，按試劑盒操作說明優化轉染條件,分別將3對siRNA以200 nmol/L的終濃度加入到T24/ADM細胞培養液中，孵育24～48 h后收獲細胞進行檢測。實驗重復3次。

1.4 RT-PCR

應用TRIZOL試劑(Gibico)提取細胞總RNA。根據NCBI中cDNA序列設計引物，以β-actin作為檢測的內參照，PCR反應引物由上海生物工程有限公司合成，其序列分別為，β-actin：F 5’-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’和R 5’-AGCCATGCCAAATGTCTCAT-3’,其cDNA擴增產物為286 bp。MDR1:F 5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’和R5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’,其擴增產物為167 bp。采用一步法進行單管RT-PCR，反應總體系為25 μl。反應完成后取10 μl樣品在2%瓊脂糖凝膠中電泳，自動電泳凝膠掃描分析系統(Chiemlmage 5500)掃描凝膠并進行定量分析。

1.5 Western方法檢測P-gp表達

將經過siRNA轉染48 h后的各組T24/ADM細胞，用PBS洗滌2次，取對數生長期的細胞，加入RIPA (美國Pierce)裂解液。冰上靜置10 min后，4℃ 、14 000 r/min，離心10 min后取上清。采用BCA法(美國Pierce)進行蛋白定量后，蛋白樣品加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，置于沸水浴中加熱10 min。蛋白樣品(每孔上樣量均為20 μg總蛋白)用SDS-PAGE凝膠(10% ，Invitrogen公司產品)進行電泳分離，分離的蛋白條帶轉移至PVD膜，并與抗人P-gP及β-actin的第一抗體于4℃孵育過夜后，再與辣根過氧化物酶標記的第二抗體反應，DAB顯色。實驗設置4組：①對照組，T24/ADM細胞；②陰性對照組，空轉染組；③T24細胞組；④轉染組。

1.6 MTT 法檢測ADM的半數抑制濃度(IC50)

將經SiRNA轉染48 h后的各組T24/ADM細胞，調整細胞濃度至1×105/ml，在96孔板的各孔中加入180 μl 細胞和不同濃度ADM，培養72 h后,加入MTT液20 μl/孔，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，充分震蕩10 min，應用酶聯免疫分析儀測波長570 nm處每孔的光密度值(A570值),按以下公式分別計算相對逆轉效率。相對逆轉效率=(IC50A-IC50B)/(IC50A-IC50C)，其中IC50A是T24/ADM細胞的IC50，IC50B是轉染siRNA的T24/ADM細胞的IC50，IC50C是T24細胞的IC50。

1.7 細胞內阿霉素(ADM)積累量的測定

將經過siRNA轉染48 h后的細胞，按1×106/ml細胞濃度與1 μg/ml的ADM 37℃共同孵育1 h后，冰浴終止ADM的作用，應用流式細胞儀檢測細胞內ADM穩態積累量。以未經過處理的T24/ADM細胞作為空白對照。

1.8 統計學處理

應用SPSS13.0進行統計學分析，統計學處理采用t檢驗，P<0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 T24/ADM 細胞MDR1 mRNA水平的變化

T24/ADM 細胞經siRNA處理48 h后，3組MDR1mRNA表達水平均下調，見圖1。陰性對照組MDR1/β-actin為0.56，另3組MDR1/β-actin分別為0.23、0.18和0.12。

圖1 T24/ADM細胞經siRNA作用48 h后MDR1 mRNA表達水平

1為si-negative；2為si-mdr1-1；3為si-mdr1-2；4為si-mdr1-3；5為陰性對照

2.2 T24/ADM 細胞P-gp蛋白表達的變化

經siRNA處理48 h后，P-gp蛋白表達均受到抑制，Western-blot檢測結果顯示，T24/ADM 細胞中P-gp蛋白表達水平較親本細胞明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組細胞與陰性對照組細胞P-gp蛋白表達比較，差異無統計學意義。轉染siRNA后的細胞P-gp蛋白表達水平明顯下降,見圖2。

2.3 T24/ADM 細胞藥物敏感性的變化

3組siRNA 作用48 h后T24/ADM 細胞對化療藥物的敏感性均增強(表1)，表明所設計的siRNA均可恢復T24/ADM 細胞對化療藥物的敏感性。

圖2 各組細胞中P-gp表達的檢測

1為對照組細胞；2為陰性對照組細胞；3為T24/ADM細胞；4為si-mdr1-1細胞；5為 si-mdr1-2細胞；6為si-mdr1-3細胞

表1 siRNA作用后T24/ADM細胞的IC50

注：與T24/ADM細胞組比較，*為P<0.05

2.4 T24/ADM細胞內ADM積累量的變化

經siRNA處理48 h的T24/ADM細胞內ADM穩態累積量明顯增高(表2)，但與敏感株T24比較，熒光強度和陽性率仍較低。

表2 siRNA處理后細胞內ADM積累量情況

注：與未經處理的T24/ADM細胞組比較，*為P<0.05

3 討論

目前，膀胱癌的化療效果不明顯，究其主要原因是腫瘤細胞中的多藥耐藥基因(MDR)的存在，導致很多化療藥物作用失敗。RNAi 作為1種新的研究工具，已經在功能基因組學領域呈現出巨大的應用前景。研究表明[2,3]體外合成的小分子dsRNA能直接觸發RNAi，這些小分子dsRNA被稱為小干涉RNA(small interfering RNA)，即siRNA。Elbashir等[4]首次報道siRNA在哺乳動物體外培養細胞內成功誘導基因特異阻抑以后，siRNA是否可應用于人類疾病的治療受到了廣泛的關注。在腫瘤基因治療中，通過人合成特定癌基因靶向的siRNA或構建siRNA的表達載體，并導入腫瘤細胞中，可以特異性地抑制目的基因的表達[5]RNAi技術的發展為逆轉多藥耐藥的基因治療提供了可能[6]。本研究以MDR1基因為目標，針對MDR1基因設計了3條siRNA序列，以探討干擾RNA技術進行多藥耐藥逆轉的可行性。結果顯示，轉染后MDR1 mRNA明顯下調，48 h后抑制率很高。并且P-gp蛋白的抑制率在48 h的時候也達到很高的水平。目前的研究發現，外源性的siRNA引發的RNAi僅為短時效應，在絕大多數哺乳動物細胞中轉染人工合成的短片段RNA后，進行基因和蛋白抑制檢測的高峰時間在轉染后的48～72 h，一般在轉染后3～5 d蛋白的抑制達到最高，5～7 d則恢復到穩定狀態。從我們的結果也可以看到，基因和蛋白的抑制基本遵循上述的規律。本研究中，ADM的IC50和ADM的穩態細胞內積累量分析證實，轉染siRNA后T24/ADM細胞對ADM的敏感性及細胞內ADM的積累量與對照組相比均有明顯差異，本實驗結果肯定了siRNA干擾能夠有效抑制MDR1基因編碼蛋白P-gp的表達，說明siRNA可能成為逆轉多藥耐藥的新方法。

總之，我們應用了針對MDR1 RNA干擾技術，可以有效地抑制MDR1 mRNA表達，能夠有效抑制該基因編碼的P-gp蛋白表達，從而有效地逆轉了腫瘤細胞的耐藥性，如果能聯合應用多種耐藥機制的siRNA，將能更有效地逆轉腫瘤細胞的耐藥性，為治療腫瘤提供新的方法。

[1]何一心，楊少光，張淑靖，等.多藥耐藥性細胞的鑒別和分離〔J〕.中華血液學雜志，1992，13：173.

[2]Scherr M，BattIIler K，Winlkler T，et al.Specific inhibition of bcr-abl gene expression by small interfering RNA〔J〕.Blood，2003，101：1566.

[3]彭 智，肖志堅，王 一，等.siRNA逆轉K562/A02細胞多藥耐藥研究〔J〕.中華血液學雜志，2004，25：5.

[4]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et,al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001,411(6836):494.

[5]Bulk E,Hascher A,Liersch R.Adjuvant therapy with small hairpin RNA interference prevents non-small cell lung cancer metastasis development in mice〔J〕.Cancer Res,2008,68(6):1896.

[6]Duan Z,Weinstein EJ,Ji D.Lentiviral short hairpin RNA screen of genes associated with multidrug resistance identifies PRP-4 as a new regulator of chemoresistance in human ovarian cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2008,7(8):2377.