蜂毒素對人肝癌裸鼠移植瘤的抗血管生成作用

宋長城 呂 祥 程彬彬 李 柏 凌昌全

肝細胞癌 (hepatocelluar carcinoma,HCC) 是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在我國腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二[1]。目前，根治性手術仍是 HCC 治療的首選方法，但術后復發和轉移是影響手術療效的關鍵因素，且 HCC 的放射及化學治療效果均不理想。因此，探索新的治療手段很有必要。從臨床上行肝動脈化療栓塞術治療 HCC 取得肯定療效來看，阻斷腫瘤血液供應的治療方法有望成為 HCC 治療的突破口[2]。蜂毒素是從蜜蜂尾部螫針排出的毒汁中分離提純的1種動物毒素。它具有抗菌、抗病毒、抗炎、鎮痛等多種生物學活性。近年來，蜂毒素的抗腫瘤作用日益受到人們關注。體外研究發現，蜂毒素可以通過不同機制對多種腫瘤細胞產生強烈的殺傷作用，是1種十分具有應用前景的抗腫瘤天然藥物。本實驗通過建立人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤模型，觀察蜂毒素對裸鼠皮下移植瘤生長的影響，探討其抗腫瘤血管生成的可能機制，以評價蜂毒素是否具有潛在的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株

4 ～ 6 周齡 BALB/C - nu/nu 雄性裸鼠，體重 18 ～ 20 g，購自中國科學院上海動物中心，動物合格證號：SCXK(滬) 2002-0002，SPF環境下飼養。人肝癌細胞株 BEL-7402 從中國科學院上海細胞研究所引進，常規傳代培養。

1.2 主要試劑

蜂毒素為 Sigma 公司產品，批號：104K4016。鼠抗人 CD34單克隆抗體、鼠抗人 HIF-1α 單克隆抗體、鼠抗人 NF-κB 單克隆抗體和兔抗人 bFGF 多抗隆抗體均購自美國 Santa Cruz 公司。SABC 免疫組化試劑盒購自武漢 Boster 公司。

1.3 方法

1.3.1 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及腫瘤生長觀測 取對數生長期 BEL-7402 細胞，調整細胞濃度至 2.5×107/ml，按 0.2 ml/只接種于裸鼠右側腋窩皮下。待皮下腫瘤直徑達 0.5 ～ 0.7 cm 時，將裸鼠隨機分為生理鹽水 (normal sodium,NS) 組、沙利度胺 (thalidomide,TLD)(200 mg/kg/d) 組、蜂毒素低、中、高劑量組 (40 μg/kg/d、60 μg/kg/d、80 μg/kg/d)。分組后第 2 d 開始給藥，每天 1 次，連續 10 d。每 2 d 測量腫瘤長( a )、短徑( b )，并稱裸鼠體重，實驗結束時復測瘤體大小并稱重。按下列公式分別計算腫瘤體積 (V)、相對腫瘤體積 (RTV) 和相對腫瘤增殖率 (T/C)：TV = a×b2/2；RTV = V/V0(V0為給藥前測量所得體積，V 為處死前測量所得體積)；T/C = 治療組 RTV/陰性對照組 RTV×100%；腫瘤生長抑制率=(1-治療組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重) × 100%。

1.3.2 免疫組化染色 嚴格按照免疫組化 SABC 試劑盒說明書進行操作。參照 Weidner[3]方法進行 MVD 評估。光鏡下可見 HIF-1α 和 bFGF 為胞質著色，NF-κB 為胞質或胞核著色，陽性表現為棕色或棕褐色。應用 IMS 細胞圖像分析系統對染色切片進行分析，免疫組化陽性表達指數=陽性面積/視野面積×光密度值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 裸鼠移植瘤生長情況

以皮下瘤體直徑達 0.5 ～ 0.7 cm 為接種成功標準，裸鼠成瘤率為 100%。治療前各組裸鼠腫瘤大小無明顯差異 (P>0.05)，提示各組瘤體具有可比性。在治療過程中，NS 組腫瘤生長較快，個別瘤體表面破潰，而蜂毒素各組及 TLD 組腫瘤生長相對緩慢。治療結束后，蜂毒素低中高劑量組及 TLD 組相對腫瘤體積與 NS 組比較，差異具有統計學意義 (P<0.01)。蜂毒素各組的相對腫瘤增殖率與 TLD 組比較差異無統計學意義 (P>0.05)，見表1。

2.2 蜂毒素對裸鼠及裸鼠移植瘤的影響

在實驗過程中各組裸鼠行動自如，反應靈敏，進食飲水正常，皮下未見出血點，無裸鼠自然死亡。實驗結束后自眶靜脈采血行外周血細胞計數。結果顯示，蜂毒素各組及 TLD 組外周血紅細胞、血紅蛋白、白細胞、血小板水平與 NS 組比較，差異無統計學意義 (P>0.05)。實驗結束后頸椎脫臼處死裸鼠，各組動物均未發現胸腔及腹腔積液。取裸鼠心、肺、肝、腎及骨組織做石蠟切片，經 HE 染色未見轉移灶。各組裸鼠用藥前、后體重見表2，實驗期間各組裸鼠體重均有增加，與 NS 組比較差異無統計學意義 (P>0.05)，提示蜂毒素在本實驗劑量范圍內無明顯毒副作用。如表 2 所示，蜂毒素各組瘤重與 NS 組比較差異均有統計學意義 (P<0.01)。與 TLD 組比較，蜂毒素中高劑量組瘤重明顯減輕 (P<0.05或P<0.01)，而低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)。蜂毒素低中高劑量組抑瘤率分別為 44.64%、62.86% 和 73.73%。

2.3 蜂毒素對裸鼠皮下移植瘤 MVD 的影響

免疫組化染色顯示，蜂毒素各組及TLD組瘤體內腫瘤微血管呈棕褐色條索狀，血管密度稀疏。與 NS 對照組比較，各藥物處理組 MVD 明顯下降 (P<0.01)。蜂毒素中、低劑量組 MVD 明顯高于 TLD 組 (P<0.01)，而高劑量組與 TLD組比較差異無統計學意義 (P>0.05)，見表3。

2.4 蜂毒素對皮下移植瘤血管生成相關蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，NS 組中 bFGF、HIF-1α 和 NF-κB 表達率高，著色較深，而蜂毒素各組及TLD組中上述血管生成相關蛋白表達率低，著色淡。結果表明，蜂毒素低中高劑量組及 TLD 組 bFGF、HIF-1α 和 NF-κB 表達水平明顯低于 NS 組 (P<0.01)。蜂毒素各組 bFGF 表達水平高于 TLD 組 (P<0.05或P<0.01)，說明 TLD 下調 bFGF 的作用較蜂毒素強；蜂毒素中高劑量組 HIF-1α 表達水平與 TLD 組比較差異無統計學意義 (P>0.05)，而低劑量組卻明顯高于 TLD 組 (P<0.05)；TLD 組 NF-κB 表達水平明顯低于蜂毒素中低劑量組 (P<0.01)，而與蜂毒素高劑量組比較差異無統計學意義 (P>0.05)，見表 3。

表1 蜂毒素對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 (±s，n=6)

表1 蜂毒素對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 (±s，n=6)

組別裸鼠(只)腫瘤體積(mm3)治療前治療后相對腫瘤體積相對腫瘤增殖率(%)生理鹽水組676．72±8．61690．06±94．699．06±1．45100．00沙利度胺組671．93±15．53317．19±90．614．40±0．89?48．61蜂毒素低劑量組672．77±15．11324．86±88．514．42±0．58?48．78蜂毒素中劑量組678．29±22．65268．24±93．253．47±0．97?38．33蜂毒素高劑量組666．78±10．37202．35±78．083．06±1．23?33．82

注：與生理鹽水組比較，*為P<0.01

表2 2 裸鼠皮下移植瘤模型治療前后體重變化及瘤體重量 (±s，n=6)

表2 2 裸鼠皮下移植瘤模型治療前后體重變化及瘤體重量 (±s，n=6)

組別裸鼠(只)裸鼠體重(g)治療前治療后瘤重(g)抑瘤率(%)生理鹽水組622．30±0．4022．17±0．660．79±0．210沙利度胺組622．25±1．3422．12±0．850．42±0．04?46．25蜂毒素低劑量組622．30±1．1823．2±0．640．44±0．04?44．64蜂毒素中劑量組623．27±0．7723．48±1．030．29±0．05?△62．86蜂毒素高劑量組622．37±1．4023．58±2．040．21±0．05?△△73．73

注：與生理鹽水組比較，*為P<0.01；與沙利度胺組比較，△為P<0.05，△△為P<0.01

表3 蜂毒素對裸鼠皮下移植瘤 MVD 及 HIF-1α、bFGF、NF-κB表達的影響(±s,n=6)

表3 蜂毒素對裸鼠皮下移植瘤 MVD 及 HIF-1α、bFGF、NF-κB表達的影響(±s,n=6)

組別微血管密度HIF-1α表達bFGF表達NF-κB表達生理鹽水組16．50±2．354．74±1．024．43±0．344．98±0．63沙利度胺組6．17±1．17?0．95±0．10?1．36±0．11?1．65±0．81?蜂毒素低劑量組11．33±1．86?△△1．53±0．15?△2．45±0．78?△△2．79±0．29?△△蜂毒素中劑量組9．17±1．17?△△1．45±0．19?△2．27±0．36?△△2．71±0．66?△△蜂毒素高劑量組6．67±1．21?1．14±0．05?△△2．10±0．27?△2．26±0．56?

注：與生理鹽水組比較，*為P<0.01；與沙利度胺組比較，△為P<0.05，△△為P<0.01

3 討論

肝癌是嚴重威脅人類健康的一大疾患，現有治療方法雖然較多，但尚無一種方法能夠單獨適用于所有患者。因此，研發高效、低毒、特異性強的抗 HCC 新藥已迫在眉睫。有研究發現，一些從天然藥物中提取的小分子物質具有抗腫瘤血管生成作用，它們可以抑制血管內皮細胞增殖，誘導其凋亡[4]。蜂毒素是 1 種最新提取、純化的小分子肽類物質，約占蜂毒干重的50%，由 26 個氨基酸組成[5]。近年來，我們實驗室對蜂毒素從提取純化到體內外抗腫瘤效果作了深入的研究。結果表明，蜂毒素在體外對骨肉瘤細胞U2OS、人肝癌細胞SMMC-7721、BEL-7402、Hep-3B 等多種腫瘤細胞的增殖具有顯著的抑制作用，并可影響腫瘤細胞周期的正常移行，阻止 S 期細胞進入 G2/M 期[6～8]。本實驗是在既往研究的基礎之上，通過建立人肝癌 BEL-7402 裸鼠移植瘤模型，進一步評價蜂毒素體內抗肝癌作用，以及對 HCC 血管生成的影響。研究結果顯示，蜂毒素可以有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，治療組腫瘤重量及體積明顯減小，并且呈劑量依賴性，在本實驗所取劑量范圍內未見蜂毒素具有明顯不良反應。

腫瘤的生長和轉移具有血管依賴性。新生血管為腫瘤組織提供充足的養分，而且發育不完善的微血管也為腫瘤細胞進入血液循環提供了便利。腫瘤微血管是腫瘤生長和轉移的病理基礎和必要條件，MVD 是評價腫瘤血管生成程度最客觀的指標。有研究表明，MVD與腫瘤臨床分期、病理分級、淋巴結有無轉移，以及患者預后有密切關系[9]。MVD 越高，腫瘤侵襲性越強、轉移越早、預后越差。在本次實驗結束時，解剖裸鼠皮下移植瘤發現經蜂毒素處理后的腫瘤組織顏色較蒼白，這可能與腫瘤微血管生成受到抑制有關。免疫組化檢測結果顯示，蜂毒素能夠有效降低裸鼠皮下移植性肝癌組織 MVD，破壞腫瘤組織的新生血管。這提示，蜂毒素可以抑制HCC血管生成，降低腫瘤MVD，影響腫瘤組織血供，遏制腫瘤生長。

HCC 是典型的富血管惡性腫瘤，豐富的血管是其快速生長、早期轉移及廣泛浸潤等生物學特性的物質基礎[10]。HCC 的血管生成是 1 個由諸多調控因子參與的多步驟級鏈反應過程，而促血管生成因子對新生血管起著正向調節作用。 bFGF 是腫瘤組織中作用最強的促血管生成因子之一[11]，它與血管內皮細胞表面特異性受體結合后促進其增殖、分化、遷移。腫瘤在生長過程中，生長較快的中心區域很容易發生缺氧，由此導致大量缺氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α) 廣泛表達，它可以結合于包括 bFGF 在內的諸多靶基因的相應位點，啟動靶基因轉錄，誘導腫瘤血管的生成，增加腫瘤血管通透性[12]。在諸多腫瘤血管生成調控因子之間，核轉錄因子 NF-κB 起核心調控作用。有研究表明，NF-κB 在缺氧和酸性條件下被激活后可增強多種促血管生成因子的轉錄，兩者協同促進腫瘤的血管生成[13]。當 NF-κB 表達受到抑制時，瘤體內的促血管生成因子表達降低。本研究結果顯示，蜂毒素可有效下調促血管生成因子 HIF-1α 和 bFGF 的表達，隨著藥物劑量的增大抑制效果愈加明顯。免疫組化檢測結果表明，蜂毒素在抑制 HIF-1α 和 bFGF 表達的同時亦下調 NF-κB 表達，影響血管生成因子之間的協同關系，從而對裸鼠移植瘤的血管生成產生良好的阻斷效應，進而抑制肝癌的生長。

綜上所述，蜂毒素具有抑制裸鼠皮下移植性肝癌生長的作用，對腫瘤的血管生成產生較強的阻斷效應，其作用機理可能與降低核轉錄因子 NF-κB 的活性，進而抑制 HIF-1α 的轉錄，影響 bFGF 等促血管生成因子的表達有關，但對其具體作用機制尚有待于進一步研究。

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