神經節苷脂對彌散性腦損傷模型大鼠認知功能的改善作用研究

楊 鵬，李 云，張志勇，孫澤林，張立民，李群喜，陳 通，張云鶴，劉清軍，鄒西峰，付愛軍，朱 軍

（1.河北聯合大學附屬醫院，唐山市 063007；2.河北聯合大學公共衛生學院，唐山市 063007）

彌散性腦損傷（Diffuse brain injury，DBI）是閉合性腦外傷的一種，是神經外科常見急癥之一，病情嚴重，致殘率及死亡率均高[1]。DBI后神經損害不僅發生在損傷瞬間，且在其后的數分鐘至數天內產生的繼發性損傷也很嚴重[2]，幸存者通常有嚴重的運動功能障礙。此外，DBI傷后還可出現神經元延遲性死亡，從而導致患者長期認知功能障礙，極大地影響了患者生活質量。神經節苷脂（Ganglioside）是近來治療DBI的常用藥物，其腦保護作用和促進神經功能恢復的作用已引起人們關注。本研究擬采用Morris水迷宮實驗和跳臺實驗研究神經節苷脂對大鼠DBI后認知功能的改善作用，旨在為治療顱腦創傷患者提供新的理論基礎和治療途徑，改善顱腦創傷患者的預后。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YLS-3TB大鼠跳臺記錄儀（上海軟隆科技發展有限公司）；SLY-WMS Morris水迷宮分析系統（北京碩林苑科技有限公司）。

1.2 試藥

10%水合氯醛（北京化學試劑公司，批號：20021109）；神經節苷脂（齊魯制藥有限公司，批號：20030508，規格：20 mg·2 mL－1），以生理鹽水稀釋至所需濃度備用。

1.3 動物

Wistar大鼠48只，♂，月齡4個月左右，體重310～390 g，由中國醫學科學院中國協和醫科大學實驗動物研究所提供，合格證號：京動許字20000006。動物喂養在河北聯合大學動物中心，自然光照，自由進食，1周后進行實驗，實驗前12 h禁食，不禁水。

2 方法

2.1 建模

根據Marmarou方法建立DBI模型[3]。于致傷前0.5 h，腹腔注射阿托品30 mg·kg－1。腹腔注射10%水合氯醛350 mg·kg－1麻醉大鼠，以75%乙醇消毒術區，沿正中矢狀線切開頭皮，剝離骨膜，顯露冠狀縫及人字縫，固定打擊墊片在大鼠冠狀縫與人字縫之間，將大鼠俯臥位固定于海綿床墊（10×10×20 cm3）上。頭部固定于致傷架下，打擊錘自2 m高度自由落下，打擊后即刻移開大鼠，以防止打擊錘造成的二次損傷。致傷后，去除打擊墊片，清創縫合傷口。保溫復蘇后繼續飼養。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機分為正常對照組、假手術組、模型組和藥物干預組，每組12只，各組間大鼠月齡、體重分布均無統計學差異。正常對照組不作任何處理；假手術組僅給予麻醉及頭皮切開、縫合，但不致傷；模型組和藥物干預組均建立DBI模型。根據參考文獻[4]，藥物干預組建模后30 min即刻經腹腔注射神經節苷脂40 mg·kg－1·d－1，其余3組在相同時間內給予等量生理鹽水，之后每天于同一時間給予相應藥物，連續給藥14 d，末次給藥后取各組大鼠進行Morris水迷宮實驗和跳臺實驗。

2.3 Morris水迷宮實驗

各組大鼠接受不同處理措施前4天為學習訓練期。第1天讓大鼠自由游泳2 min，從第2天起，每天分上、下午2段，每段訓練4次，訓練時隨機選擇一個入水點，將大鼠面向池壁放入水中，訓練其在180 s內找到安全平臺。如果大鼠在180 s內未找到安全平臺，需將其引至安全平臺。每次訓練間隔60 s。采用水迷宮實驗圖像追蹤系統自動記錄大鼠在訓練前及訓練后的活動路線圖。經過4 d的學習訓練后，大鼠都能在180 s內順利找到安全平臺。

訓練完成后將大鼠分組，末次給藥后去掉安全平臺再次進行水迷宮實驗，將大鼠面向池壁，隨機選擇一個入水點放入池中，根據水迷宮實驗圖像追蹤系統記錄結果，計算大鼠在180 s內搜索安全平臺的次數、第1次穿過安全平臺的時間及在靶像限活動時間，評價大鼠認知功能。

2.4 跳臺實驗

根據參考文獻[5]，將大鼠放入箱內銅柵上，適應5 min，隨后通電，大鼠受電擊，正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數大鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。從大鼠電擊后逃到安全臺上開始記時，再從安全臺上下來此段時間為潛伏期，大鼠從安全臺上再次跳下為錯誤反應。如果5 min內大鼠未跳下平臺，錯誤次數記錄為0次，潛伏期記為300 s。各組大鼠接受不同處理措施前1天為學習訓練期，末次給藥后重新測試各組大鼠，記錄潛伏期和錯誤次數。

2.5 統計學方法

數據均用均數±標準差表示，經Excel數據庫整理后應用SPSS 11.0統計軟件，計量資料進行t檢驗或方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 建模結果

建模后，24只大鼠均出現呼吸抑制和心跳暫停，給予吸氧、人工呼吸、心臟胸廓按壓等搶救措施后，有9只呼吸心跳未能恢復，于傷后l h內死亡，存活大鼠15只，死亡率為37.5%。所有模型大鼠均出現四肢劇烈抽搐，持續15～30 s，隨后，前肢呈去皮層屈曲，昏迷狀態，多于30 s內恢復心跳和自主呼吸。存活大鼠于5～60 min內清醒，前肢恢復正常。模型大鼠在72 h內反應遲鈍，而正常對照組和假手術組大鼠活動正常。

3.2 水迷宮實驗結果

正常大鼠水迷宮實驗學習訓練前和訓練后活動路線圖見圖1。

圖1 正常大鼠水迷宮實驗活動路線圖A.訓練前；B.訓練后Fig 1 Morris water maze route map of normal ratsA.before training；B.after training

由圖1可知，正常大鼠在訓練前第1次找到安全平臺的時間和路線均較長；經過學習訓練后，大鼠第1次找到安全平臺的時間和路線均較短，水迷宮實驗成績明顯提高。表明大鼠對安全平臺位置產生了一定的記憶。末次給藥后各組大鼠水迷宮實驗活動路線圖見圖2。

由圖2可知，正常對照組和假手術組大鼠水迷宮實驗成績相近，大鼠活動路線集中在靶像限內，表明大鼠學習記憶功能受影響較小；而模型組和藥物干預組大鼠水迷宮實驗成績較差，大鼠活動路線分散在各個像限，表明大鼠學習記憶功能受不同程度的影響。與正常對照組和假手術組比較，模型組和藥物干預組大鼠第1次穿過平臺時間明顯延長，搜索安全平臺次數、在靶像限活動時間均明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，藥物干預組大鼠第1次穿過平臺時間明顯縮短，搜索安全平臺次數、在靶像限活動時間均明顯增加（P＜0.05）。各組大鼠水迷宮實驗指標比較見表1。

圖2 各組大鼠水迷宮實驗活動路線圖A.正常對照組；B.假手術組；C.模型組；D.藥物干預組Fig 2 Morris water maze route map of rats in each groupA.normal control group；B.sham operation group；C.model group；D.drug intervention group

表1 各組大鼠水迷宮實驗指標比較（x ±s）Tab 1 Comparison of Morris water maze index among different group（s±s）

表1 各組大鼠水迷宮實驗指標比較（x ±s）Tab 1 Comparison of Morris water maze index among different group（s±s）

與正常對照組和假手術組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group and sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

分組正常對照組（n=12）假手術組（n=12）模型組（n=7）藥物干預組（n=8）F在靶像限活動時間/s 123.51±5.91 118.28±5.10 61.38±8.67＊84.59±6.78＊#83.39第1次穿過平臺時間/s 4.62±0.58 5.28±0.71 10.15±1.35＊8.02±1.09＊#70.42搜索安全平臺次數/次10.1±1.9 10.3±1.8 3.8±2.3＊6.8±1.3＊#24.18

3.3 跳臺實驗結果

與正常對照組和假手術組比較，模型組和藥物干預組大鼠潛伏期時間明顯縮短，錯誤次數明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，藥物干預組大鼠潛伏期時間明顯延長，錯誤次數明顯減少（P＜0.05）。各組大鼠跳臺實驗結果比較見表2。

4 討論

有研究[6]發現，大鼠腦外傷后細胞凋亡高峰出現于傷后48 h，這種傷后神經元的延遲性死亡，可導致長期認知功能障礙。本研究結果進一步證實了DBI后遲發性細胞死亡對大鼠認知功能有一定影響，同時也提示在臨床上應盡量減少DBI后的遲發性細胞死亡，從而減輕腦DBI后的認知障礙。此外，本研究中正常對照組和假手術組大鼠在實驗第14天搜索安全平臺次數的差別無統計學意義，因此可以排除頭皮切開等應激反應對大鼠水迷宮實驗結果的影響。

表2 各組大鼠跳臺試驗結果比較（±s）Tab 2Results of step-down test among different group（s±s）

表2 各組大鼠跳臺試驗結果比較（±s）Tab 2Results of step-down test among different group（s±s）

與正常對照組和假手術組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group and sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

錯誤次數/次4.8±1.2 4.6±1.5 9.7±2.8＊7.5±2.3＊#14.36分組正常對照組（n=12）假手術組（n=12）模型組（n=7）藥物干預組（n=8）F潛伏期/s 264.83±16.99 262.51±21.54 179.28±31.24＊230.46±24.63＊#25.33

神經節苷脂是從牛腦中提取和純化的一種復合神經節苷酯，臨床證明，其能明顯促進外周神經損傷、脊髓損傷和糖尿病神經病變中受損神經的再生和功能恢復[7]；在腦缺血中早期有護腦作用，后期有促進神經功能恢復作用，且具有周圍神經鎮痛作用。本研究也發現，藥物干預組大鼠在180 s內找到安全平臺的次數和在靶像限內活動時間明顯高于模型組大鼠（P＜0.05），第1次穿過平臺時間明顯低于模型組（P＜0.05），跳臺實驗潛伏期時間延長，錯誤次數減少。其原因可能為藥物干預組大鼠使用神經節苷脂后，通過減少神經元的凋亡，改善了大鼠的認知能力。神經節苷脂改善大鼠認知能力的可能機制包括：（1）神經節苷脂可促進神經元的軸突再生，刺激突觸形成、激發細胞膜上Na+-K+-ATP酶的活性，增強細胞內蛋白磷酸化過程并改善神經傳導速度，從而改善大鼠認知功能；（2）神經節苷脂具有較強的修復神經組織損害的潛力，能加速神經支配功能的恢復。

本研究證實了神經節苷脂對DBI模型大鼠認知能力有改善作用，這也提示在DBI后應盡早使用促進神經組織恢復的藥物，以改善患者的預后。

[1] Graham DI，McIntosh TK，Maxwell WL，et al.Recent advances in neurotrauma[J].J Neuropathol Exp Neurol，2000，59（8）：641.

[2] 楊秀江，黎成祿.腦彌漫性軸索損傷76例[J].中華創傷雜志，2007，23（6）：437.

[3] 張勁松，何 斌，邵 斌，等.神經節苷脂對大鼠腦缺血再灌注后一氧化氮合酶的影響及機制[J].中國急救醫學，2007，27（11）：1 009.

[4] 王海英，劉家浩，唐洪麗，等.神經節苷脂GM1與亞低溫對缺氧缺血后腦中HSP70、NPY表達的影響[J].江蘇醫藥，2007，31（8）：569.

[5] 徐小林，漆蘇洋，陳銀寶，等.小劑量納洛酮與氯胺酮合用對小鼠學習記憶的影響[J].中國藥房，2010，21（5）：397.

[6] Conti AC，Raghupathi R，Trojanowski JQ，et al.Experimental brain injury induces regionally distinct apoptosis during the acute and delayed post traumatic period[J].Neuroscience，1998，18（15）：5 663.

[7] 宋 英，李 萌，劉建仁，等.神經節苷脂調節PKC信號通路及其對PC12細胞去血清損傷的保護作用[J].解剖學報，2007，38（3）：315.