氯解磷定注射液細菌內毒素檢查法的建立

王貴英（貴州省藥品檢驗所，貴陽市 550004）

氯解磷定注射液屬于解毒藥類，臨床上主要用于有機磷酸酯類中毒的解救，主要用法有肌內注射和靜脈注射。該藥收載于衛生部藥品標準1996年版（二部）第五冊[1]，原質量標準中無安全性檢查項。為了更好地控制其質量，筆者查閱了相關資料，雖有文獻[2]報道復方氯解磷定注射液細菌內毒素的檢查方法，但關于氯解磷定注射液的細菌內毒素檢查方法尚未見文獻報道。筆者參照《中國藥典》2010年版[3]（二部）附錄“細菌內毒素檢查法”及相關文獻[2]，對氯解磷定注射液應用鱟試劑進行細菌內毒素檢查的方法可行性作了研究。

1 儀器與試藥

電熱恒溫水浴箱（國營創新醫療器械廠）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

氯解磷定注射液（上海旭東海普制藥有限公司，批號：090902、091001、091101、100301，規格：0.5 g ∶2m L）；鱟試劑（以下簡稱TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批號：0807170，規格：每支0.1m L，靈敏度：0.25 EU·m L－1；湛江安度斯生物有限公司，批號：1004162，規格：每支0.1m L，靈敏度：0.25 EU·m L－1）；細菌內毒素工作標準品（批號：2007-4，效價：每支150 EU）、細菌內毒素檢查用水（以下簡稱BET水，批號：2008-04，規格：每支10m L）均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值（L）的確定

根據氯解磷定注射液說明書得知該藥用法用量為：肌內注射，每次0.75～1.0 g；靜脈注射，每次0.5～0.75 g。嚴重中毒：1～1.5 g（2～3支）。根據公式：L＝K·M－1，其中M為1 500 mg·60 kg－1·h－1＝25mg·kg－1·h－1；K＝5 EU·kg－1·h－1，則限值L＝0.2 EU·mg－1，最終確定限值為0.2 EU·mg－1。

2.2 TAL靈敏度復核

按照《中國藥典》2010年版（二部）“細菌內毒素檢查法”規定[3]，進行TAL的標示靈敏度復核，結果2批TAL經細菌內毒素工作標準品檢查靈敏度（λc）與標示靈敏度（λ）一致，結果均符合規定，詳見表1（表中“+”表示反應呈陽性，“-”表示反應呈陰性；下表同）。

表1 TAL靈敏度復核結果Tab 1 Recheck of TAL sensitivity

2.3 干擾試驗預試驗

2.3.1 樣品有效稀釋濃度（MVC）的計算[2]。計算公式為MVC＝λ·L－1，由于L為0.2 EU·mg－1，λ為TAL標示靈敏度，目前市售TAL的λ通常為0.5～0.03 EU·m L－1，則氯解磷定注射液的對應有效稀釋濃度為c0.5＝2.5mg·m L－1、c0.25＝1.25mg·m L－1、c0.125＝0.625mg·m L－1、c0.06＝0.3mg·m L－1、c0.03＝0.15mg·m L－1。

2.3.2 試驗操作。將樣品（批號：090902）用BET水稀釋為含氯解磷定濃度20、10、5、2.5、1.25、0.625mg·m L－1的溶液，將此系列濃度溶液記為NPC。另制備同樣系列濃度的供試液，并使每一濃度的供試液中均含有2λ（0.5 EU·m L－1）濃度的細菌內毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL，分別與上述NPC和PPC進行反應，每一濃度重復2管，并設陽性對照記為PC和陰性對照記為NC，混勻后封口，置于37℃恒溫水浴60m in，反應結果見表2。

表2 樣品干擾試驗預試驗結果Tab 2 Resultsof prelim inary interference testof samp les

表2結果表明：用靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL對樣品進行細菌內毒素試驗，結果樣品濃度在10mg·m L－1及以下濃度時無抑制干擾作用。

2.4 正式干擾試驗

為了最終確認是否存在抑制因素的影響，進行正式干擾試驗。取3批樣品用BET水稀釋至10mg·m L－1，用該濃度溶液和BET水分別將細菌內毒素工作標準品稀釋成含內毒素0.5（2 λ）、0.25（λ）、0.125（0.5 λ）、0.06（0.25 λ）EU·m L－1的溶液，分別與2個廠家靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL反應，每一濃度重復4管，并設陰性對照，按《中國藥典》2010年版（二部）“細菌內毒素檢查供試品干擾試驗”項[3]進行試驗，結果見表3。

表3 樣品干擾試驗結果Tab 3 Resultsof interference testof sam ples

表3結果表明：3批樣品濃度為10mg·m L－1時用2個廠家靈敏度均為0.25 EU·m L－1的TAL進行試驗，結果BET水制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es）在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及供試品溶液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）在0.5 Es～2 Es（包括0.5 Es和2 Es）內，符合《中國藥典》規定，確認供試品在該濃度下無干擾作用。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

按《中國藥典》2010年版（二部）“細菌內毒素檢查法”[3]，將4批樣品稀釋至濃度為10mg·m L－1，設立NPC、PPC、PC和NC，用2個廠家靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL進行細菌內毒素檢查，結果見表4。

3 討論

表4 4批樣品細菌內毒素檢查結果Tab 4 Results of bacteria endotoxin test for four batches of samp les

由預干擾試驗結果可知，氯解磷定注射液稀釋至10mg·m L－1及以下濃度后與靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL反應無抑制性干擾。正式干擾試驗用3批樣品稀釋至濃度為10mg·m L－1，用2個廠家靈敏度為0.25 EU·m L－1的TAL進行試驗，結果Es/Et均在0.5～2內，確認無干擾影響。對4批樣品依法檢驗，結果均符合規定。

與文獻[2]方法比較，二者限值（L）相同，但文獻方法是將理論限值降低了0.05 EU·mg－1而成0.2 EU·mg－1，因為復方制劑要求更加嚴格。因此參照文獻[2]，本文在進行干擾試驗預試驗時，最低濃度只稀釋到0.625mg·m L－1，節約了成本。2種方法不同之處在于進行方法驗證試驗時，對樣品進行細菌內毒素檢查所用的稀釋濃度不同：文獻方法是按最小有效稀釋濃度（1.25mg·m L－1）進行試驗，本文則按預試驗時確定的不干擾濃度（NIC，10mg·m L－1）進行試驗[4]。因為預試驗的目的就是為了確定NIC，為后續的驗證試驗選擇適當的樣品稀釋濃度。樣品在較高的稀釋濃度下進行內毒素檢查能合格，更能說明方法是可行的，既減少了稀釋步驟和污染環節，也節約了成本和時間。有關文獻[5]要求驗證試驗選擇的稀釋度至少要比NIC大1～2倍，但不可超過最大有效稀釋倍數。

本試驗結果證實，氯解磷定注射液細菌內毒素限值確定為0.2 EU·mg－1，可應用TAL進行細菌內毒素法檢查。因此，為提高藥品質量標準，更有效地控制藥品質量，建議氯解磷定注射液增加細菌內毒素檢查項。并擬定質量標準如下：取本品，依法檢查，每1mg氯解磷定中含內毒素的量應小于0.2EU。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準（二部）[S].1996年版.第5冊.1996：101.

[2]高 錦，付 聰，嵇 揚，等.復方氯解磷定注射液細菌內毒素的檢查方法[J].藥學實踐雜志，2008，26（2）：133.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄99-100.

[4]彭 燕，施 震，羅 毅.鹽酸左氧氟沙星注射液中細菌內毒素法的研究[J].中國藥房，2005，16（1）：60.

[5]王彥厚.細菌內毒素檢查方法建立中應注意的幾個問題[N].新藥注冊臨床信息快訊，2007：43.