水牛乳過(guò)氧化物酶特性的研究

陳曉亮，曹曉燕，王士長(zhǎng)，陳瑞芳，黃怡

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

水牛乳過(guò)氧化物酶特性的研究

陳曉亮，曹曉燕，王士長(zhǎng)，陳瑞芳，黃怡

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530005）

以第三代摩拉×本地奶水牛的新鮮乳為原料，對(duì)乳中過(guò)氧化物酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性、最適pH值、pH值穩(wěn)定性以及光穩(wěn)定性用ABTS進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，乳中過(guò)氧化酶最適合溫度在55℃附近，且在40℃以下穩(wěn)定性較好；最適pH值在5.5附近，pH值為3.0～8.0都很穩(wěn)定；日光燈照射條件下，酶的穩(wěn)定性較差而避光條件下相對(duì)較好。這些研究將為南方以及廣西地區(qū)水牛乳的保鮮提供了部分依據(jù)。

水牛乳；乳過(guò)氧化物酶；特性

0 引言

水牛乳的總干物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分均比黑白花牛乳高[1，2]。隨著人們對(duì)水牛乳優(yōu)秀品質(zhì)的認(rèn)識(shí)，國(guó)家加大了投資開(kāi)發(fā)力度[3]，奶水牛迎來(lái)了歷史發(fā)展的最好時(shí)期[1]。

水牛具有在水里浸泡的生理需要，因此，大多奶水牛養(yǎng)殖場(chǎng)分散在與乳品加工廠相距較遠(yuǎn)的偏遠(yuǎn)地區(qū)，由于條件限制，而無(wú)法實(shí)現(xiàn)冷凍保鮮[4]，過(guò)氧化物酶體系（Lacperoxidase System，LPS），它包括乳過(guò)氧化物酶（Lacperoxidase，LP），硫氫酸鹽(SCNˉ)，過(guò)氧化氫（H2O2）。該體系對(duì)細(xì)菌抑制和殺菌作用[5-7]。剛擠出的牛奶由于本身具有LPS體系，在一定時(shí)間內(nèi)，使細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。LPS體系的活性受溫度、pH值以及光照等因素的影響。本實(shí)驗(yàn)以ABTS[2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽]作為顯色底物與乳過(guò)氧化物酶反應(yīng)，在波長(zhǎng)412 nm下測(cè)定其吸光度，通過(guò)計(jì)算得出酶活特性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

水牛乳。泌乳母牛牛舍飼，手工擠奶，自由飲水，以青貯玉米、象草等為主，補(bǔ)充精料。擠奶后立即取樣，-20℃保存。醋酸，濃HCl，NaOH，醋酸鈉均為分析純ABTS。

1.2 溶液配制及樣品處理

醋酸-醋酸鈉緩沖液：取13.608 g醋酸鈉，溶液后定容至1000 mL，即為濃度0.1 mol/L的醋酸鈉溶液；取5.9 mL冰醋酸定容至1000 mL，即為濃度0.1 mol/L的醋酸溶液。取354.8 mL醋酸鈉溶液與1000 mL醋酸溶液混合即可配制濃度為0.1 mol/L（pH=4.3）的緩沖溶液；315 mL醋酸鈉溶液與500 mL醋酸溶液混合即可配制濃度為0.1 mol/L（pH=4.5）的緩沖溶液。

H2O2溶液：取1.13 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2用濃度為0.1 mol/L（pH=4.3）醋酸-醋酸鈉緩沖液定容到1000 mL，即為濃度1 mmol/L的H2O2溶液。

ABTS溶液：取0.275 gABTS用濃度為0.1 mol/L（pH=4.5）醋酸-醋酸鈉緩沖液定容到500 mL，即為濃度1 mmol/L的ABTS溶液。

樣品溶液：將冷凍樣品在4℃[8]冰箱解凍后，在4 000 r/min離心15 min,除去上層乳脂。然后在脫脂乳總加入7倍的濃度為0.1 mol/L（pH=4.3）的醋酸鹽緩沖液，混合均勻，沉淀酪蛋白，將這中混合液在4 000 r/ min離心15 min，即可得到12%的乳清稀釋液[9]。

1.3 設(shè)備

752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；DELTA320 PH計(jì)；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋；高速冷凍離心機(jī)。

2 方法

2.1 活性的測(cè)定

2.1.1 檢測(cè)原理

還原型ABTS在乳過(guò)氧化酶的作用下與H2O2生成氧化性ABTS，氧化型ABTS為綠色物質(zhì)，根據(jù)顏色的深淺，借助分光光度計(jì)，產(chǎn)生不同的吸光值，從而換算成待測(cè)樣的酶活性[9]。

2.1.2 檢測(cè)方法

取1.2中處理過(guò)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%乳清稀釋液30 μL于比色皿中，加入2.7 mL，濃度為1 mmol/L的ABTS溶液，混勻，置于紫外分光光度計(jì)中，在412 nm[10]處調(diào)吸光值為零。然后加入30 μL，濃度為1 mmol/L的H2O2溶液，混勻，記錄單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化，計(jì)算LPS活力[9-12]。以25℃條件下，每分鐘內(nèi)反應(yīng)催化1 μmol的ABTS所需要的酶量為一個(gè)酶活單位[13]，即

LP活力=△ATVn·103/(ξLSV)，

式中：△A為單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化；TV為反應(yīng)體系體積；ξ為ABTS摩爾吸光系數(shù)；L：比色杯光徑；SV為乳清稀釋液樣本體積。

2.2 最適溫度的測(cè)定

取1.2中配置的樣品溶液，即12%的乳清稀釋液9份，置于小燒杯中，每份20 mL,分別于20，30，40，50，55，60，70，80℃恒溫水浴放置一段時(shí)間。待樣品的溫度與所設(shè)定水浴溫度達(dá)到一致后，然后按3.1方法測(cè)定測(cè)定水恒溫水浴牛乳過(guò)氧化物酶的活性。

2.3 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

取1.2中配置的樣品溶液9份，置于小燒杯中，每份20 mL,分別于20，30，40，50，55，60，70，75，80℃恒溫水浴中放置。分別在0.5，1，2，3 h取樣按3.1方法測(cè)定。

2.4 最適pH值的測(cè)定

取1.2中配置的樣品溶液13份，置于小燒杯中，每份20 mL，在25℃的恒溫水浴中放置一段時(shí)間，待樣品溶液溫度與恒溫水浴一致，用濃度為1 mol/L的HCl和濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)整pH值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0。然后取樣按3.1方法測(cè)定。

2.5 pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

取1.2中配置的樣品溶液11份，置于小燒杯中，每份20 mL，用濃度為1 mol/L的HCl和濃度為1 mol/L的NaOH調(diào)整pH值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，于25℃的水浴鍋中放置。分別于20，40，60，80，100，120 min取樣按3.1方法測(cè)定。

2.6 光照條件下穩(wěn)定性的測(cè)定

取1.2中配置的樣品溶液6份，每份20 mL，平均分成兩組，在室溫（25℃）下，一組置于日光燈條件下，一組置于避光條件下放置。分別在0.5，1，2，3 h取樣品按3.1方法測(cè)定。

2.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2007軟件處理并利用Spss18.0和Photoshop7.0繪制曲線圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 最適溫度

圖1為乳過(guò)氧化酶的最適溫度。由圖1可以看出，水牛牛乳中過(guò)氧化物酶在50～60℃活性較高（其中50℃時(shí)酶活是4.22 U/mL，55℃是4.73 U/mL，60℃是4.48 U/mL）：低于50℃時(shí)，測(cè)試溫度越高，酶的活性越高；而高于60℃時(shí)，測(cè)試溫度越高，酶的活性降低速度越快。因此酶的最適合溫度為55～60℃。該結(jié)果比王瑋[14]等人測(cè)定的羊乳中的酶活最適溫度45～55℃高一些，而低于Kussendrager[15]報(bào)道乳過(guò)氧化物酶的最適溫度為70℃。這可能與取樣、測(cè)定環(huán)境、飼養(yǎng)環(huán)境以及不同乳源中成分、結(jié)構(gòu)不同有關(guān)系。還應(yīng)當(dāng)注意的是，水牛乳中的過(guò)氧化物酶在低溫情況下的活性要相對(duì)高一些；高溫下，乳過(guò)氧化物酶活性相對(duì)較低，80℃時(shí)僅為0.93 U/mL。而Korhonen[16]報(bào)道牛乳在巴氏消毒（63℃下加熱30 min，72℃下加熱15 s）后，乳中過(guò)氧化酶物仍有一定活性，但是在80℃下2.5 s被完全破環(huán)。另一方面，de Wit和van Hooydonk[17]也報(bào)道說(shuō)牛乳中乳過(guò)氧化物酶在78℃下15 s完全失活。Mark[18]在2001年報(bào)道說(shuō)一般巴氏消毒后牛奶中乳過(guò)氧化物酶仍然有一定活性，但是在80℃加熱15 s后活性基本喪失。在本實(shí)驗(yàn)中可以看到在80℃下，并未完全失活，這就為結(jié)合利用巴氏消毒法和LPS對(duì)水牛乳保鮮提供了重要的依據(jù)。

3.2 熱的穩(wěn)定性

圖2為乳過(guò)氧化酶熱的穩(wěn)定性。由圖2可以看出，水牛乳中乳過(guò)氧化物酶在20～40℃處理3 h殘留酶活保持較高水平，在90%以上（20℃處理3 h后殘留酶活為原來(lái)的97%，30℃為原來(lái)的90%，40℃為原來(lái)的89.5%）；在50～55℃的環(huán)境中保持3 h，乳過(guò)氧化物酶殘留活性明顯降低，其中50℃環(huán)境下處理3 h后殘留酶活為原來(lái)的53.5%而在55℃下處理3 h后為原來(lái)的46.5%，這可能是由于部分酶失活的原因；在60℃環(huán)境中保持3 h，殘留酶活只有原來(lái)的10%，而高于60℃的環(huán)境中，在3 h后基本失活，沒(méi)有活性。由此可見(jiàn)，水牛乳中的過(guò)氧化物酶在40℃以下可以保持較高的殘留酶活。

3.3 最適pH值

圖3為乳過(guò)氧化酶的最適pH值。由圖3可以看出，水牛乳的乳過(guò)氧化物酶在小于pH=5.5時(shí)，隨著測(cè)試pH值的升高，酶的活性升高；在大于pH=5.5時(shí)，隨著測(cè)試pH的繼續(xù)升高，酶的活性降低。pH值在5.0～5.5的時(shí)，活性最高（pH值為5.0時(shí)酶活是2.16 U/mL，pH為5.5時(shí)酶活是2.18 U/mL），且比較穩(wěn)定。因此可見(jiàn)水牛乳中過(guò)氧化物酶的活性在pH值為5.5附近。這與Kumar[14,19]報(bào)道的水牛和黑白花牛牛乳中乳過(guò)氧化物酶最適pH值都為6.0及Mustapha Blel[20]所報(bào)道的最適pH值為6.7有所不同，引起的這種差異的原因可能是牛的品系、代數(shù)以及飼喂條件。

3.4 pH的穩(wěn)定性

圖4為乳過(guò)氧化酶pH值的穩(wěn)定性。由圖4可以看出，在pH值為3.0到8.0的范圍內(nèi)，水牛乳中過(guò)氧化物酶的穩(wěn)定性較好，在2 h測(cè)定中，除pH值為3.0外，大多數(shù)酶活殘留量可以保持在90%以上，但值得注意的是在pH值為3.0的情況下對(duì)酶活的抑制更強(qiáng)一些。這與王瑋[20]所報(bào)道的羊乳中乳過(guò)氧化物酶的性質(zhì)類似。

3.5 光照的影響

圖5為光照對(duì)水牛乳的乳過(guò)氧化酶的影響。由圖5可以看出，日光燈照射對(duì)水牛乳的乳過(guò)氧化酶的影響很大，3 h內(nèi)在光照條件下，酶的殘留活性降低了約29%，遠(yuǎn)大于在避光條件下酶的殘留活性。由此可見(jiàn)水牛乳的乳過(guò)氧化酶是一種對(duì)光很敏感的酶，光照可以很大程度抑制酶的活性。

4 結(jié)論

水牛乳中過(guò)氧化物酶的最適溫度在55～60℃，較低溫度（40℃）下的穩(wěn)定性較好，最適pH值為5.5，在pH值為3.0～8.0相對(duì)穩(wěn)定。光照對(duì)乳過(guò)氧化物酶影響較大。

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Study on the lactoperoxidase characteristics in waterbuffalo milk

CHEN Xiao-liang,CAO Xiao-yan,WANG Shi-chang,CHEN Rui-fang,HUANG Yi
(Collage of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530005,China)

Fresh milk of Murrah×local third filial generation waterbuffalo was collected to analysis lactoperoxidase characteristics.The influences of temperature,pH and light on the lactoperoxidase activity were investigated with using 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)diammonium salt.The results showed that lactoperoxidase had a good stability below 40℃and the most suitable temperature was 55℃in the vicinity.The optimum pH for lactoperoxidase was around 5.5 and it had a high stability when pH is between 3.0 and 8.0. The enzyme had a poor stability under light condition,while a good stability when avoiding light.These researches will provid some basis for the freshing of waterbuffalo milk in South area of China as well as in Guangxi province.

waterbuffalo milk;lacperoxidase;lacperoxidase activity

S823.9+1

A

1001-2230（2011）06-0004-04

2011-06-18

陳曉亮（1985-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗Ｈ榈拈_(kāi)發(fā)利用。

黃怡