嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸的測定方法

郝巖平，張秋梅，王象欣

（東北農業大學，黑龍江省乳品工業技術開發中心，哈爾濱 150086）

嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸的測定方法

郝巖平，張秋梅，王象欣

（東北農業大學，黑龍江省乳品工業技術開發中心，哈爾濱 150086）

采用堿性磷酸酶先將樣品中的核苷酸酶解為核苷，然后用高效液相色譜法測定嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸總量。試樣經水提取，通過調pH值沉淀蛋白質，樣液中的核苷酸經堿性磷酸酶水解生成核苷，再通過快速加熱的方式終止酶解反應，同時進一步去除雜質，用磷酸二氫鉀及甲醇作流動相，用普通C18色譜柱，采用梯度洗脫的模式對5種核苷進行有效分離。本方法回收率在92.4%～103.7%之間，相對標準差2.0%～8.0%。核苷酸各組分定量限：CMP為0.6 mg/100g，UMP為0.7 mg/100g，IMP+AMP為0.5 mg/100 g，GMP為0.4 mg/100 g（均為質量分數）。該方法簡便、快速、準確,完全能滿足嬰幼兒配方食品中核苷酸總量測定的要求。為核苷酸檢測開辟了全新的途徑。

配方食品；乳粉；核苷酸；核苷；高效液相色譜

0 引言

人乳中天然的核苷酸質量濃度很高，而牛乳中天然核苷酸質量濃度低，為了使牛乳更接近母乳許多企業在乳粉中添加核苷酸，現在在嬰兒配方食品和奶粉中添加的核苷酸品種主要有以下5種：胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸。

目前一些企業采用濕法工藝生產嬰幼兒配方食品，在標準化工藝階段添加核苷酸后，由于乳中本身含有一定量的磷酸酶會使核苷酸脫磷酸而變成核苷導致核苷酸結果偏低，又因核苷的生理作用與核苷酸近似，若只檢測核苷酸，不能真實反映出產品中核苷酸的含量。本研究用堿性磷酸酶先將樣品中的核苷酸酶解為核苷，以核苷為測定目標物，建立了高效液相色譜法測定嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸總量的簡便、準確的檢驗方法。

1 儀器與材料

主要儀器：天平，pH計，培養箱，電爐，水浴鍋，微波爐，高效液相色譜儀：配有二極管陣列檢測器或紫外檢測器。

試劑：淀粉酶，鹽酸，氫氧化鈉，乙酸，醋酸鈉，堿性磷酸酶，疊氮化鈉，甲醇，磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，核苷酸標準品，核苷標準品。

2 樣品的處理方法的確定

2.1 蛋白質分離的方式

樣品的處理主要考慮的是既能將樣品中的蛋白質分離出去，又能將核苷酸無損失的提取出來。為此將樣品用水溶解，用質量分數為10%乙酸及調pH值的方法沉淀蛋白質：10%乙酸沉淀蛋白沉淀蛋白質的方法是將充分溶解的樣品轉入50 mL容量瓶中，加入5 mL質量分數為10%乙酸，定容，充分混勻后用濾紙過濾；調pH法沉淀蛋白質的方法是用稀鹽酸溶液將充分溶解的樣品溶液的pH值調至4.5，轉入50 mL容量瓶中用水定容，混勻，用濾紙過濾。上述濾液通過0.45 μm的濾膜過濾后上機測定。通過對測定色譜圖進行分析后發現：上述處理方式沉淀蛋白，雜質峰都多，且與目標峰分離不開。進一步去除雜質后，通過調pH來沉淀蛋白質的方法雜質少，分離情況好，根據上述蛋白質分離方法的比較，確定采用調pH值來沉淀蛋白質的方法。

2.2 最佳酶解的條件的選擇

酶解pH值的選擇：經過大量的實驗確定酶解的最佳pH值為8.2。

酶用量及酶解時間長度的選擇：堿性磷酸酶價格較高，它的用量直接影響到酶解的效果及本方法的操作成本和檢測速度，實驗表明堿性磷酸酶的用量越大需要的酶解時間越短，堿性磷酸酶用量越少需要的酶解時間越長，經過大量實驗摸索比對，結果表明每1 g樣品用30活力單位的酶，酶解3 h即可達到最佳效果。

2.3 去除其他雜質的方式

在去除蛋白后還有許多雜質影響分析，曾經考慮采用預柱分離的方法去除這些雜質，試過幾種預柱，效果都不理想，經過與預柱專家細致的討論切磋后決定放棄使用預柱分離，并大量查閱資料，同時與乳品工藝專家請教討論，嘗試著在沉淀蛋白過濾后酶解前進一步調樣品的pH值到堿性，酶解后加熱，去除雜質。實驗過程如下：調pH值所用試劑的選擇：使用磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉調樣品的pH值至堿性，酶解后加熱，去除雜質。結果表明用氫氧化鈉調pH值的效果比用其他緩沖鹽調pH值的效果要好，雜質明顯的少，故選定用氫氧化鈉調pH值。

pH值的控制：pH值從7.5～9.0作了大量實驗，結果表明pH值為8.2為最佳，即可滿足酶解的要求又可有效的去除雜質。

加熱方式的選擇：比較了用微波爐加熱、熱水浴加熱及電爐加熱等加熱方式，感覺差別不大，但加熱速度應盡量快，鑒于微波對人體有害、熱水浴加熱速度慢且不方便，故采用事先預熱好的電爐加熱的方式。

3 色譜條件

3.1 色譜柱的選擇

色譜柱性能是待測物能否達到理想的分離度、方法成功的關鍵之一。

在色譜柱的選擇上，先后采用了phenomenex Luna 5 μm C18 250mm×4.60mm，phenomenexLuna 5 μm C18 150mmⅹ4.60mm，diamonsil C18 5 μm 250mm× 4.60mm結果發現：phenomenexLuna 5 μm C18 150mm×4.60mm柱分離效果好，檢測時間短。因此，選用phenomenex Luna 5 μm C18 150mm×4.60mm柱。

3.2 流動相的選擇

3.2.1 流動相的組成成分的選擇

資料上測定核苷酸的流動相種類很多，有用水的、磷酸鹽、草酸鹽、醋酸鹽的等等，經過比較磷酸鹽效果更好一些，選用濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鉀作為流動相主成分，鹽的濃度極低對于色譜柱的壽命大有益處。

3.2.2 流動相的pH值

流動相的pH值影響到目標物質的出峰時間及與雜質的分離效果，考慮到各個核苷的性質，對pH值在3.0～7.0之間的流動相進行實驗，試驗證明：pH為6.0時，經過酶解后的核苷酸的5個色譜峰以及雜質峰能夠完全分開，靈敏度比較高，最終確定選擇pH值為6.0。

3.2.3 甲醇的體積分數

由于色譜柱分離耗時極長，我們考慮在流動相中加入部分甲醇，以縮短分離時間，經過大量實驗最終決定在流動相B液中加入質量分數為10%的甲醇。

3.3 梯度洗脫條件的選擇

由于色譜分離耗時極長，一度達到一個樣品在色譜儀上運行需要的時間為1.5 h，無論怎么調整都沒有明顯效果，最終決定采用梯度洗脫的方法，經過大量摸索確定了洗脫條件，在下面條件下每個樣品色譜分離所需時間縮短為22 min。

表1 梯度洗脫程序

4 核苷酸轉化成核苷的轉化率

用核苷標準品對核苷酸標準溶液進行測定，每份標準溶液加1 mg堿性磷酸酶、酶解3 h，對每種核苷酸轉化為核苷的效率進行了實驗研究。結果表明：CMP、UMP與GMP 3種核苷酸轉化為核苷的轉化率達100%；由于在酶解過程中，其中的AMP全部轉化為肌苷，所以最終測定的實際上是AMP與IMP之和。經試驗證明與分別對AMP與IMP酶解后的測定結果之和與混合酶解后的測定結果無差異，說明AMP全部轉化為肌苷后對測定核苷酸總量結果不受影響。實驗結果如表2所示。

5 標準和試樣核苷酸色譜圖

圖1～圖3為核苷酸標樣、樣品、樣品+核苷酸（復合）色譜圖。圖中出峰順序為CMP（3.75min），UMP（5.35min），IMP（+AMP）（10.6min），GMP（11.5min）。

表2 核苷酸轉化率統計結果

表3 核苷酸標準系列質量濃度及峰高間回歸方程與相關系數

6 標準曲線的繪制

將核苷酸標準溶液用pH值為8.2±0.1的水稀釋成不同濃度的標準系列，加堿性磷酸酶，放入培養箱中在37℃下培養3 h。取出，放在事先預熱好的電爐上，強火加熱至剛剛沸騰，取下冷卻至室溫，水定容配成核苷酸系列標準工作液。

分別用不同濃度的標準工作液進樣，以濃度為橫坐標，峰高為縱坐標，繪制標準工作曲線，通過回歸計算求得回歸方程和相關系數，可見在一定質量濃度范圍內質量濃度與峰高間呈正相關，相關性好，可用于外標法進行定量測定，結果如表3所示。

7 準確度實驗

選擇奶粉、豆粉、米粉作為測試樣品，并向樣品中加入一定量的標準溶液，采用前面確定的方法處理測定，結果如表4所示。

由表4可以看出，回收率均在92.4%～103.7%之間，該方法準確度滿足實驗要求。

表4 方法回收率實驗

8 精密度實驗

取奶粉、豆粉、米粉樣品各3個梯度，每個梯度重復測定6次，結果如表5所示。

由表5可以看出，各類樣品各個梯度的日內重復測定標準偏差均小于10%，符合實驗要求。

9 檢出限及定量限

9.1 方法最低檢出限

根據GB/T5009.1-2003，中A 2.1色譜法的計算方法。計算檢出限：

表5 奶粉、豆粉、米粉各低、中、高3種濃度下的日內重復性實驗mg·(100g)-1

式中：b為標準曲線回歸方程中的斜率，響應值/微克或響應值/納克；S為儀器噪音的3倍，即儀器能辨認的最小的物質信號。結果確認檢出限：CMP為0.07 mg/L；UMP為0.08 mg/L；IMP+AMP為0.05 mg/L；GMP為0.04 mg/L。

9.2 樣品定量限

根據定量限定義，以信噪比為10倍時的溶液濃度為定量限，考慮稱樣量及樣品處理過程中的稀釋倍數，計算出本方法樣品的定量限如下：

10 最終實驗方法的確定

樣品處理：5 g樣品溫水溶解，調pH值為4.5，用水定容50 mL，過濾，加堿性磷酸酶，調pH值為8.2，在37℃下酶解3 h，取出快速加熱沸騰，冷卻定容，過濾，上機。

色譜條件：流動相A液濃度為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH值為6.0），質量分數為0.02%迭氮化鈉；了流動相B液濃度為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH值為6.0），質量分數0.02%迭氮化鈉，質量分數為10%甲醇。色譜柱為C18色譜柱（150×4.6 mm，5 μm）；流速為1 mL/min；波長為254 nm；柱溫為（30±2）℃；進樣體積為50 μL。色譜程序如表6所示。

表6 梯度洗脫程序

11 結論

經實驗驗證：本方法的簡便、快速、可操作性強、成本低，其準確性、重現性、檢出限等完全能滿足嬰幼兒配方食品中核苷酸含量測定的要求。

本方法適用于嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸總量的測定。包括：胞嘧啶核苷酸（CMP），尿嘧啶核苷酸（UMP），腺嘌呤核苷酸（AMP），鳥嘌呤核苷酸（GMP），次黃嘌呤核苷酸（IMP）。

12 討論

12.1 核苷酸酶解為核苷情況

從牛腸黏膜提煉而來的堿性磷酸酶（p7640），可以將5種核苷酸脫磷酸轉化為相應的核苷：胞嘧啶核苷酸（CMP）轉化為胞苷，尿嘧啶核苷酸（UMP）轉化為尿苷，腺嘌呤核苷酸（AMP）轉化為腺苷，鳥嘌呤核苷酸（GMP）轉化為鳥苷，次黃嘌呤核苷酸（IMP）轉化為肌苷，其中的腺苷進一步脫氨轉化為肌苷。腺苷進一步轉化為肌苷的程度因酶解條件的不同而變化，經試驗無論轉化程度如何，其腺苷和肌苷含量的總和基本不變。鑒于本標準測定的是五種核苷酸的總量，為提高測定結果的準確度，采用了可使腺苷全部轉化為肌苷的酶解條件，計算時只計算IMP的質量分數。其他三種核苷酸仍分別計算，核苷酸總量即為實際測定的是涵蓋有AMP的五種核苷酸測定結果的總和。

12.2 本方法核苷酸測定結果的討論

由于堿性磷酸酶在將核苷酸轉化為核苷后，測定的實際上是測定核苷的量。由于樣品中往往存在質量分數不等的游離態核苷成分，該法測定結果也包括在內，所以測定結果往往比實際添加的核苷酸偏高。對于以乳基為主的樣品中的本地值較低，其核苷酸的測定結果差異較小；但對于含豆基的樣品則本底值相對較高。采用該法分別對全脂奶粉與速溶豆粉樣品進行了本底值的測定：全脂奶粉一般在（2～10）mg/100g，速溶豆粉一般在（20～100）mg/100g。由此可看出：采用該法測定的核苷酸質量分數并非全部為添加的核苷酸，還包括了樣品本身含有的核苷等。所以在使用不同的原料時應注意本地值的質量分數，以便使產品中核苷酸的總量不要超過標準規定。

本方法樣品處理過程中不加堿性磷酸酶可直接測定樣品中的游離核苷質量分數。

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[3]張燕婉,魯紅軍,王津生.高效液相色譜法測定食品中核苷酸的含量[J].食品科學,1994(6):59-62.

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Research on determination of nucleotides in infant formula food and milk powder

HAO Yan-pin，ZHANG Qiu-mei，WANG Xiang-xin
（Northeast Agricultural University,Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Harbin 150086,China）

We first employ alkaline phosphatase to hydrolyze nucleotides to the corresponding nucleosides and establish a method for which detects the total nucleotides in infant formula food and milk powder using HPLC.The sample is extracted by water,and eliminated of protein by adjusting pH.Then the nucleotides in sample are degraded into nucleosides.This enzyme has been heat deactivated in order to stop reaction and remove impurities further.The chromatographic separation was achieved using a C18 column and a gradient elution with a mixture of two solvents,which effectively separate five kinds of nucleosides.The range of recovery rates of is 92.4%～103.7%and the range of relative standard deviations is 2.0%～8.0%.The detection limits for these nucleotides are:CMP 0.6 mg/100 g、UMP 0.7 mg/100 g、IMP+AMP 0.5 mg/100 g and GMP 0.4 mg/100 g.Conclusion:The method which offers a new way to detect the nucleotides is simple,rapid and accurate and it can completely meet the detection of total nucleotides in infant formula food and milk powder.

formula food；milk powder；nucleotides；nucleosides；HPLC

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0048-05

2010-12-21

郝巖平（1960-），女，高級工程師，研究方向為乳品檢測及食品安全。