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乳清蛋白肽抗氧化活性的研究進展

2011-01-08 05:40:02劉晶苗穎趙征
中國乳品工業 2011年4期

劉晶,苗穎,趙征

(1.天津科技大學食品與生物技術學院,天津 300457;2.河北經貿大學生物科學與工程學院,石家莊 050061;3.天津農學院食品科學系,天津 300384)

乳清蛋白肽抗氧化活性的研究進展

劉晶1,2,苗穎1,3,趙征1

(1.天津科技大學食品與生物技術學院,天津 300457;2.河北經貿大學生物科學與工程學院,石家莊 050061;3.天津農學院食品科學系,天津 300384)

綜述了乳源蛋白肽的研究現狀和乳清蛋白肽的抗氧化途徑。乳清蛋白肽通過清除自由基,螯合金屬離子,減少氫過氧化物和改變食品物理性狀等方式起到抗氧化作用。探討了氨基酸組成及乳清蛋白肽的結構與抗氧化活性之間的關系。易于供氫的氨基酸最易被氧化起到抗氧化作用,抗氧化活性還受到多肽空間結構的影響。測定乳清蛋白肽抗氧化活性的方法很多,由于測定條件和測定指標的不同,研究者往往得出截然相反的結論??寡趸钚噪膩碓簇S富,乳清蛋白肽顯示出一定的優勢,具有廣泛的市場應用前景。

乳清蛋白肽;抗氧化活性;清除自由基;螯合金屬離子;多肽結構

0 引言

機體具有防御活性氧進攻的機制,包括抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等)和內源性抗氧化劑(如谷胱甘肽等)。當活性氧超出了防御機制的承受能力,氧化應激產生了,這會導致重要的細胞成分發生損害[1]。Laakso[2]和Rival[3]等研究發現牛乳酪蛋白能夠抑制脂氧合酶裂解的脂類自動氧化和自由基清除活性。Statue-Gracia[4]等發現乳鐵傳遞蛋白在富含鐵的嬰兒食品中能夠抑制由鐵催化的氧化作用。Pe?a-Ramosa[5]等研究發現乳清蛋白酶解物在脂質氧化體系中可以防止脂質過氧化。瑞士乳桿菌發酵乳清蛋白形成的肽類物質表現了良好的抗氧化特性[6]。Cheison[7]等人用蛋白酶Protease N Amano G水解乳清分離蛋白,其DPPH清除能力有所提高。乳清蛋白肽的抗氧化作用日益成為研究的熱點。

1 乳清蛋白肽抗氧化的途徑

生物活性肽通常含有3~20個氨基酸,在母體蛋白長的肽鏈中,這段肽通常沒有活性,經過消化酶、微生物酶或食品加工水解后具有活性的肽段才被釋放出來。蛋白具有極好的抗氧化作用是因為它能夠抑制脂類氧化。途徑主要有以下幾個方面[8]:使活性氧失活,清除自由基,螯合金屬離子,減少氫過氧化物以及改變食品體系的物理性狀等。由于蛋白具有抑制脂類氧化的作用,這使它成為生物組織抗氧化防御體系中重要的組成成分。與其它抗氧化劑相比,蛋白的抗氧化有其獨特之處。

1.1 清除自由基

色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有抗氧化活性,因為酚羥基和吲哚基團可以作為供氫體,形成酚和吲哚自由基,這兩種自由基的穩定性高,與過氧化物自由基相比半衰期長,因此抑制了自由基鏈式反應的增殖和傳遞,起到抗氧化作用。半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、組氨酸(His)和苯丙氨酸(Phe)也易于成為供氫體,清除自由基[9,10]。Rival[11]等人認為,俘獲自由基的過程往往伴隨著蛋白質、多肽的氧化。Met殘基的氧化是可逆的[12],蛋氨酸亞砜還原酶可以將Met的氧化態——蛋氨酸亞砜還原為Met,Met清除自由基被氧化形成蛋氨酸亞砜,這也是Met有效清除活性氧的抗氧化機制之一。為了有效清除自由基,蛋白肽必須要比不飽和脂肪酸更易于氧化,且生成的蛋白肽自由基不會引發脂類的氧化。Met非常易于氧化,在其它氨基酸氧化前,Met已經通過氧化有效地清除了自由基[13]。在β-乳球蛋白中,沒有發現Met的氧化,主要是Met卷曲在蛋白結構的內部,難于接觸到氧化劑。起抗氧化作用的氨基酸為Cys和Try。

自由基攻擊氨基酸側鏈的選擇性與能量之間呈負相關。具有低到中等還原電位值(E0'≈1000,pH7)的自由基(如氫過氧自由基)比具有高還原電位值(E0'=2310,pH7)的自由基(如羥基自由基,HO·)對氨基酸側鏈的選擇性強[14]。例如,HO·能夠任意攻擊氨基酸的側鏈,沒有選擇性。因此蛋白肽在清除自由基時,不同的氨基酸組成對清除氫過氧自由基的影響較大,而對HO·影響要小。

1.2 螯合金屬離子

蛋白對金屬的螯合主要體現在:改變過渡金屬的物理位置,將金屬與易于氧化的脂類和氫過氧化物分隔開;形成水不溶性金屬-蛋白復合物;降低過渡金屬的化學活性;在空間上阻礙金屬與脂類和過氧化物的相互作用[15]。蛋白螯合金屬的能力與pH有關,當pH值高于等電點時,蛋白質所帶的凈電核為負電荷,與金屬離子通過靜電吸引結合在一起,抑制了由金屬離子催化的脂類氧化反應。一分子的鐵傳遞蛋白(transferrin)和乳鐵蛋白(lactoferrin)可以螯合兩分子的鐵離子,卵傳鐵蛋白(ovotransferrin)可以結合3個鐵離子,鐵蛋白(ferritin)可以結合4 500個鐵離子。血清白蛋白可以結合一個銅離子,銅藍蛋白結合6個銅離子。Faraji[16]等人發現乳清分離蛋白(10 mg/mL)可以結合185umol的鐵。Tong[17]等人發現乳清蛋白抑制脂類氧化的機制之一就是將鐵從水包油型乳狀液的表面移走,改變了鐵的物理位置,抑制了大馬哈魚油的氧化。

1.3 減少氫過氧化物

谷胱甘肽可以減少脂類氫過氧化物的形成,從而抑制了脂類氧化。LOOH+2GSH→LOH+H2O+ GSSH,其中LOOH為脂類氫過氧化物,GSH為還原型谷胱甘肽,GSSH為氧化型谷胱甘肽[18]。乳清蛋白在脂肪氧化初期,可以抑制氫過氧化物和共軛二烯的形成,在鏈傳遞過程中可以使氫過氧化物降解,阻止其形成硫代巴比妥酸反應產物(TBARS)[16-20]。

1.4 改變食品的物理性狀

乳清蛋白可以作為天然的抗氧化劑加入到食品中。為了提高食品氧化穩定性,可以采用以下幾種方式處理蛋白[21]:其一是改變蛋白的結構;其二是通過基因工程引入抗氧化蛋白;其三是用抗氧化蛋白作為食品添加劑。乳清蛋白可以抑制脂類的氧化,因此富含脂肪的肉類制品中加入水解乳清蛋白可以改善食品品質。Pe?a-Ramosa[19]等人將乳清分離蛋白的水解物加入到熟豬肉餅中,由Protamex水解的乳清蛋白抗氧化性顯著提高,抑制了脂類氧化中間產物——共軛二烯和TBARS形成。胰凝乳蛋白酶和風味蛋白酶僅延遲了共軛二烯的形成,對TBARS沒有影響。說明了蛋白肽抗氧化性的提高與蛋白酶的特異性有關。蛋白的加入也會為食品品質帶來影響,如產生凝膠或粘度升高影響食品質構,發生美拉德反應影響產品的色澤,以及產生苦味物質影響產品的風味等。

2 氨基酸和肽的結構與抗氧化的關系

2.1 氨基酸的氧化和疏水性與其抗氧化的關系

盡管理論上20種氨基酸都可通過氧化反應起到抗氧化作用,但抗氧化活性最高的是含有親核基團如硫的半胱氨酸和Met或含有芳香族側鏈的Trp、Tyr和Phe[9,10]。在這些氨基酸中,氫容易從基團上脫離出來發生氧化反應,His中的咪唑基側鏈也易于被氧化。Tong[17]等人對水解乳清蛋白氨基酸殘基中的巰基進行封閉,并應用于Tween20穩定的水包大馬哈魚油的乳狀液,與未對巰基進行封閉的水解乳清蛋白相比,抑制TBARS形成的能力減少了60%,清除過氧化物自由基的能力減少了20%。表明封閉后的Cys巰基缺少了可游離出來的氫,不能發生氧化反應起到抗氧化作用。

Chen[22]和Rajapakse[23]等人認為肽的抗氧化活性與疏水性氨基酸有關。氮端具有疏水性氨基酸如纈氨酸(Val)和亮氨酸(Leu)的肽具有更高的抗氧化活性,因為疏水性氨基酸可以捕獲脂類自由基。在肽鏈中含有Pro、Tyr和His也能夠提高肽的抗氧化性。中性蛋白酶適于酶解蛋白產生抗氧化肽,因為它能夠在疏水氨基酸部位如Leu、Phe和Tyr處切斷蛋白。多肽可以作為物理屏障在脂肪球表面形成保護膜,阻止脂類物質氧化,同時多肽的表面活性可以改變脂肪球膜的表面特性。Chaiyasit[20]等人發現具有長疏水性尾巴的肽類表面活性劑可以提高脂質體的氧化穩定性。

2.2 肽鏈的氨基酸序列與抗氧化的關系

Lance[24]等人對酸乳清采用超濾、透析、加熱和氯仿抽提等處理后,發現分子量在500~5000、極性且熱穩定的乳清蛋白水解物是主要的抗氧化劑。Blanca[25]等人測定了用Corolase PP水解乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,得到了具有較高抗氧化性的肽鏈。氨基酸和肽鏈的抗氧化能力指數(以熒光素作為指示蛋白,ORACFL)值,如表1所示。等摩爾的氨基酸混合物與相應肽的抗氧化性相比,前者的抗氧化活性要高,表明肽鍵或者肽的空間結構對抗氧化性有負面影響。在另一篇研究報告中,Blanca[26]等人用游離氨基酸混合物和相應的β-lg f(19–25)肽鏈的抗氧化能力指數(ORAC)值進行比較,肽鏈的抗氧化性要高。這說明肽鍵或肽的空間結構對抗氧化性的影響與氨基酸組成和自身的結構有關。

表1 乳源蛋白肽與氨基酸的ORAC值

自由基清除能力的不同與蛋白酶水解蛋白形成的肽的大小和氨基酸序列有關。表2為乳源抗氧化肽的氨基酸序列。

Elias[33]等人用胰凝乳蛋白酶水解β-乳球蛋白(β-lg),將水解物應用于Brij乳化的水包油型乳狀液中,酶解后蛋白肽清除過氧化物自由基和螯合鐵的能力增強,通過液相色譜-質譜聯用測定了3個易于氧化的氨基酸殘基(Tyr、Met和Phe)的氧化率。在兩個12個氨基酸肽鏈中,Tyr和Met在脂類氧化前分別有39%和55%發生了氧化,在14個氨基酸肽鏈中的Phe則沒有發生顯著的氧化。研究認為,Tyr和Met可以改善分散于食品中的脂類的氧化穩定性。Woo[34]等人用胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶分別酶解乳蛋白,采用清除ABTS●+作為抗氧化性的測定指標,得出胰凝乳蛋白酶酶解乳清后蛋白肽具有最高的抗氧化活性,而胰蛋白酶酶解后的酪蛋白具有最高的自由基清除活性。這表明蛋白來源不同,氨基酸組成有差異,造成了酶解后形成肽鏈的抗氧化性不同。

2.3 蛋白肽的結構和抗氧化的關系

蛋白總的抗氧化性可以通過其四級結構的破壞得到提高,溶劑更容易接觸到氨基酸的抗氧化活性部位。氨基酸的抗氧化活性受到多肽和蛋白四級結構的影響,因為部分具有抗氧化性的氨基酸埋在蛋白內核之中,很難接觸到活性氧類物質。天然的β-乳球蛋白中的半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸等高抗氧化性的氨基酸都聚集在蛋白的內部,很難具有較高的自由基清除能力。通過熱處理或酶解等方式可以提高其抗氧化能力。Elias[35]等人于95℃、30 min熱處理β-乳球蛋白,提高了其在水包鯡魚油乳狀液中的抗氧化活性。在加熱的過程中蛋白與體系中的還原糖發生美拉德反應,反應的產物也具有抗氧化作用。Yusuf[36]等人在120℃加熱His和葡萄糖的混合物,加熱時間分別為10、20、和30 min,混合物的ORACPE(以β-藻紅蛋白作為指示蛋白)值分別為0.25、0.43和0.44 umolTrolox當量/mg反應混合物。

3 測定乳清蛋白肽抗氧化性的方法

基于不同的抗氧化機制,有許多方法可以用于測定乳蛋白的抗氧化結果。如抑制脂質過氧化能力、清除自由基能力(如清除DPPH、ABTS●+、HO·、O2-等自由基)、還原活性和體內實驗等[18]。方法包括直接與活性氧產生相互作用,與金屬離子發生反應,通過化學測定手段測定氧化的影響(如直接測定氧化的氨基酸的量)等。由于測定系統中存在其它成分,或氧化產生的方式差異,或者測定氧化的分析方法的不同,造成許多研究結果不一致。如Salami[37]等人用胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和嗜熱菌蛋白酶水解乳清蛋白(牛奶調整pH4.6,除去酪蛋白),得到分子量小于5 ku的肽具有較高的抗氧化特性,研究采用清除ABTS●+作為抗氧化性的測定方法。Tong[38]等人發現在Tween20作為乳化劑的大馬哈魚油乳化液中,乳清的高分子量部分在抑制TBARS和脂類過氧化物的形成方面比低分子量部分具有更高的抗氧化活性。Pe?a-Ramos[39]等人用堿性蛋白酶、Protamex和風味蛋白酶(Flavourzyme)水解乳清分離蛋白1 h,分子量>45 km的肽具有比低分子量部分和總的混合物高的抗氧化活性,測定指標為TBARS值。

表2 牛奶蛋白中提取的抗氧化性肽[27]

4 乳清蛋白肽的應用前景

除了乳源蛋白肽外,其它的動物源和植物源的蛋白肽也被發現具有抗氧化性。Lin[40]等人在用蛋白酶酶解膠原蛋白前,利用微波協助并加酸預處理蛋白,提高了水解效率。在達到相同抗氧化效率的前提下,縮短了水解時間。Dávalos[41]等人用胃蛋白酶水解天然雞蛋清,發現具有強血管緊張素轉換酶抑制活性的肽段Tyr-Ala-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu也具有高的自由基清除活性,延遲了由銅離子催化的低密度脂蛋白的脂類氧化。Saiga[42]等人發現由木瓜蛋白酶和Actinase E酶酶解后的豬肌纖維蛋白具有抑制亞麻酸過氧化的作用。此外玉米蛋白[43]、大豆蛋白[19]和明膠[44]等都被發現具有抗氧化性。與這些來源的蛋白肽相比,開發乳源抗氧化肽具有廣泛的市場應用前景[45],一方面是因為廣泛的市場認可度:人們已經意識到乳源物質的營養保健功能。酸奶、鮮奶、奶酪等乳制品已經成為人們日常飲食中不可或缺的食品。另一方面,乳源蛋白肽尤其是乳清蛋白肽價格比較低廉,抗氧化性等保健功能強,性價比可以滿足普通消費者的需求。因此對乳清抗氧化肽的研究具有理論和實踐的雙重意義。

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Research on antioxidative capacity of whey protein-derived peptides

LIU Jing1,2,MIAO Ying1,3,ZHAO Zheng1
(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China;2.College of Bioscience and bioengineering,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang 050061,China,3.Department of food science,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)

The research on milk protein-derived peptides and antioxidative way of whey protein-derived peptides were summarized.whey protein-derived peptides could be used as antioxidants,which could scavenge free radical,chelate metal ion,reduce hydrogen peroxide,and change food physical property.The relationship between variety of amino acid,the structure of peptide and antioxidative activity was discussed.Amino acids with the capacity of hydrogen donating were easy to oxidize,which was one of the antioxidative mechanism of peptides. Spatial structure also had the effect on the antioxidative capacity of peptides.Because of the different determination methods and indice,conflictive results could be obtained.Whey protein-derived peptides possessed superiority,compared with other peptides,and have widespread market prospect.

whey protein-derived peptide;antioxidative capacity;scavenging free radical;chelating metal ion;polypeptide structure

Q935

B

1001-2230(2011)04-0031-05

2011-01-04

劉晶(1974-),女,副教授,研究方向為乳與乳制品加工。

趙征

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