植物乳桿菌B28產細菌素的發酵條件研究

程建軍，李想，郭明若，2，吳瓊

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2.佛蒙特大學，美國伯靈頓 05403）

植物乳桿菌B28產細菌素的發酵條件研究

程建軍1，李想1，郭明若1，2，吳瓊1

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；2.佛蒙特大學，美國伯靈頓 05403）

從來自保加利亞傳統燕麥飲料中分離得到的植物乳桿菌B28出發，以臘樣芽胞桿菌Baeillus cereus為指示菌，研究了植物乳桿菌B28生長特性以及產生細菌素的最佳時期；不同氮源、碳源和磷酸鹽對細菌素抑菌活性性影響以及不同濃度硫酸銨溶液對細菌素的鹽析效果。結果表明，植物乳桿菌B28在37℃條件下培養，14～16 h，生長進入穩定期；產生細菌素最佳發酵時間為24 h；70%的硫酸酸銨是適植物乳桿菌細菌素的鹽析質量分數為。與對照培養基對比，植物乳桿菌B28的生長情況是酵母提取物＞大豆蛋白＞胰蛋白胨、蛋白胨、肉膏；乳糖＞D-果糖、蔗糖、D-麥芽糖＞D-木糖；磷酸鹽對植物乳桿菌B28的生長影響不大。并得到了產生細菌素的最佳培養基配方。

植物乳桿菌；細菌素；培養基

0 引言

長期以來，乳酸菌廣泛應用于食品的發酵與防腐中。許多乳酸菌除產生乳酸、乙酸和過氧化氫外，還可產生一些具有抑菌生物活性的細菌素(bacteriocin)，在食品的防腐保鮮方面起重要作用。它是某些細菌核糖體內合成的具有抗菌活性的多肽、蛋白質或蛋白質復合物。

植物乳桿菌素（plantaricin）是植物乳桿菌（L.plantarum）代謝過程中合成并分泌到環境中的一類具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽物質。國內外許多研究表明，由乳酸菌產生的細菌素以及其抑菌活性的高低與發酵培養條件有著密切的關系。因此，本研究對來自保加利亞發酵燕麥飲料中分離的植物乳桿菌B-28所產細菌素的發酵條件進行了優化，以期為此細菌素的進一步研究與應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種和培養基

試驗菌為植物乳桿菌Lactobacillus plantarumB28，指示菌為臘樣芽胞桿菌Baeillus cereus；基礎培養基為MRS培養基和普通肉湯培養基。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌生長曲線的測定

在MRS液體培養基中，按106mL-1的比例接種植物乳桿菌，37℃條件下培養，每隔2 h測定發酵液的pH值，同時將發酵液稀釋5倍，采用分光光度計測定不同培養時間植物乳桿菌菌懸液的600 nm的吸光值。

將不同發酵時間的植物乳桿菌稀釋成不同倍數，MRS固體培養基平板計數，做平行實驗，以發酵時間為橫坐標，以植物乳桿菌的對數值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.2 產生細菌素高峰期的確定

在MRS液體培養基中，按106mL-1的比例接種植物乳桿菌，37℃條件下培養，從發酵培養10 h開始，每隔2 h取樣，低溫條件下8 000 g離心15 min。上清液添加硫酸銨至飽和度70%，4℃下靜置1 h，鹽析后8 000 g離心15 min，所得沉淀用濃度為20 mmol/L（pH值為6.2）的磷酸鹽緩沖溶液溶解，層析純化后，研究不同發酵時間的植物乳桿菌素抑菌活性的大小。

1.2.3 鹽析對細菌素活力的影響

植物乳桿菌發酵液8 000 g離心15 min，向上清液中分別添加硫酸銨至飽和度20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%；4℃下靜置1h，然后8 000 g離心15 min，所得沉淀用濃度為20 mmol/L（pH值為6.2）的磷酸鹽緩沖溶液溶解，Sephadex-G25層析純化后，以臘樣芽胞桿菌（Baeillus cereus）為指示菌，φ7.8 mm的牛津杯作抑菌試驗，以抑菌圈直徑大小比較不同飽和度硫酸銨對植物乳桿菌細菌素抑菌活性的影響。

1.2.4 氮源對細菌素產率及活力的影響

將MRS基本發酵培養基中的含氮物質分別選用質量分數為2%的大豆蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等作為唯一的氮源，其他成分不變配制培養基，作單因素實驗。

按106mL-1的比例接種植物乳桿菌B-28，37℃條件下培養24 h，同時以基本發酵培養基為對照測定發酵液的pH值，同時將發酵液稀釋5倍后，在分光光度計上測定600 nm的吸光值。

發酵液8 000 g離心、70%（NH4）2SO4鹽析、Sephadex G-25層析。比較不同培養基對植物乳桿菌細菌素抑菌活性的影響。研究不同氮源對植物乳桿菌生長及產生細菌素的影響。

1.2.5 碳源對細菌素產率及活力的影響

將MRS基本發酵培養基中的碳源分別用質量分數為2%的D-果糖、蔗糖、D-木糖、D-麥芽糖和乳糖等不同碳源取代葡萄糖，單因素實驗，配制發酵培養基；以研究不同碳源對植物乳桿菌生長及產生細菌素的影響。

1.2.6 磷源對細菌素產率及活力的影響

將MRS基本發酵培養基中的磷酸鹽分別用質量分數為0.2%的KH2PO4和NaH2PO4取代MRS中的K2HPO4，配制發酵液。以研究不同磷酸鹽類對植物乳桿菌生長及產生細菌素的影響。

1.2.7 最佳培養成分優化培養基

將優化碳源、氮源和磷酸鹽后的成分配制成新的發酵培養基，按106mL-1接種植物乳桿菌B-28，37℃條件下培養2 h，同時以原MRS基本培養基為對照，比較優化前后培養基對植物乳桿菌素活性的影響。

2 結果和討論

2.1 植物乳桿菌生長特性

圖1為不同發酵時間植物乳桿菌的生長特性；圖2為植物乳桿菌的生長曲線。

由圖1和圖2可以看出，37℃條件下培養，植物乳桿菌B-28在1～4 h時，生長緩慢，繁殖較少，OD值和菌落總數增長較小，植物乳桿菌處于遲緩期；6～14 h，植物乳桿菌B-28生長迅速，菌體以幾何級數增長，OD值和菌落總數迅速增加，產酸速度快，處于對數生長期；發酵大約14～16 h就進入穩定生長期，植物乳桿菌B-28菌數仍在增長，但大體處于穩定狀態，說明繁殖數和死亡數大體平衡。

在14 h時，600 nm的OD值突越到0.829；16 h時，pH值大約為3.97，植物乳桿菌數突越到1.51×109mL-1。pH值的變化大約滯后OD值和菌落總數變化2 h，說明了植物乳桿菌物質代謝和積累滯后于菌體的生長。

2.2 細菌素高峰期的確定

從研究結果可以看出，植物乳桿菌的生長穩定期是在發酵14～16 h后，而發酵產物的積累滯后于乳酸菌的生長，因此，本研究從植物乳桿菌B-28發酵10 h后開始測定植物乳桿菌素的抑菌活性，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，在本研究的范圍內，隨著發酵時間的延長，植物乳桿菌素抑菌活性一直在平穩緩慢增加，10～16 h，抑菌活性逐漸增加，16～22 h處于穩定期，24 h時，植物乳桿菌細菌素抑菌效果達到了最高峰，此后，隨著發酵時間的延長，活性又處于一個相對穩定期，因此，本研究確定植物乳桿菌B-28產生植物乳桿菌素最佳的發酵時間為24 h。

2.3 鹽析對細菌素活力的影響

圖4為不同質量分數硫酸銨鹽析對細菌素產量及抑菌活性的影響。由圖4可以看出，植物乳桿菌B-28發酵上清液在不同硫酸銨濃度下鹽析，對植物乳桿菌素粗品產量和抑菌圈大小的影響，二者變化趨勢基本保持一致。

質量分數為20%飽和度的硫酸銨鹽析，沒有收集到植物乳桿菌粗品的沉淀；隨著硫酸銨濃度的增加，植物乳桿菌素粗品的產率逐漸增加，在60%飽和度時，細菌素的得率突增到0.61 g/100mL；70%飽和度時，達到最大得率為0.77 g/100mL；此后，植物乳桿菌素粗品的得率呈現下降趨勢，但基本趨于穩定。

植物乳桿菌素的抑菌活力從30%飽和度的硫酸銨鹽析后逐漸增加，在60%～70%飽和度的硫酸銨溶液鹽析后達到最大，60%飽和度時，抑菌圈直徑達到了1.60 cm；70%飽和度時，抑菌圈直徑達到了1.57 cm，此后抑菌活力降低，并趨于平穩。

產生這種情況的原因可能是由于低濃度的硫酸銨溶液使植物乳桿菌素的溶解度增加，因此，20%飽和度硫酸銨鹽析，沒有收集到沉淀；高濃度的硫酸銨溶液使植物乳桿菌素的溶解度降低，得到的沉淀物增加，但高濃度的硫酸銨可能會使植物乳桿菌素的活性降低，因此，植物乳桿菌素在80%～90%飽和度硫酸銨鹽析后，活性出現了下降的趨勢。

綜合植物乳桿菌素粗品的產率和抑菌活性的大小，確定70%飽和度的硫酸銨溶液為最佳鹽析濃度。

2.4 氮源對B-28生長及細菌素抑菌活性的影響

在保持總氮質量分數為2%不變的前提下，分別以大豆蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等作為唯一氮源，取代MRS基本培養基中的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物組成的混合氮源對植物乳桿菌B-28的生長特性及植物乳桿菌素抑菌活性的影響如圖5和圖6所示。

由圖5可以看出，OD值和pH值變化趨勢是相互吻合的，即植物乳桿菌數量的增長和產生乳酸的變化趨勢基本吻合的。

以基本發酵培養基為對照，在不同氮源中，植物乳桿菌B-28的生長情況是以酵母提取物作為氮源的培養基優于基本發酵培養基，而大豆蛋白與基本發酵培養基效果基本一致，胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏單獨作為氮源所產生植物乳桿菌素的抑菌作用低于對照，如圖6所示。

在相同培養條件下，不同氮源對植物乳桿菌素的活性影響大小依次為大豆蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏，而且植物乳桿菌B-28在含大豆蛋白胨、酵母提取物培養基中所產生的植物乳桿菌素活力明顯高于對照。

大豆蛋白胨能夠有效促進植物乳桿菌的生長和植物乳桿菌素抑菌活性的提高，可能是由于植物乳桿菌B-28本身就是分離于傳統保加利亞發酵小麥飲料，所利用的氮源與大豆蛋白胨中所含有的氨基酸同源或是氨基酸組成比較相似的緣故。因此，最佳氮源為大豆蛋白胨和酵母提取物，并作進一步的復配研究。

2.5 碳源對B-28生長及細菌素抑菌活性的影響

在保持總碳質量分數2%不變的前提下，分別以D-果糖、蔗糖、D-木糖、D-麥芽糖和乳糖作為唯一碳源取代MRS基本培養基中的葡萄糖，其對植物乳桿菌B-28的生長特性及植物乳桿菌素抑菌活性的影響如圖7和圖8所示。由圖7和圖8可以看出，植物乳桿菌生長曲線和酸度（pH值）的變化趨勢基本吻合。

以基本發酵培養基為對照，在不同碳源中，植物乳桿菌B-28在乳糖為碳源的培養基上生長，OD值高于對照，說明乳糖特別適用于乳酸菌的生長；D-果糖、蔗糖、D-麥芽糖與對照培養基的生長狀況基本相似，但D-木糖促進植物乳桿菌生長的效果最差，OD值最小，說明D-木糖不適于植物乳桿菌B-28的生長。

在相同培養條件下，不同碳源對植物乳桿菌素的活性影響大小依次為D-果糖、D-木糖、蔗糖、D-麥芽糖，雖然植物乳桿菌在乳糖為碳源的培養基上生長旺盛，但其產生的植物乳桿菌素沒有活性。

氮源對植物乳桿菌生長和植物乳桿菌素抑菌活力方面并沒有表現出一致性，乳糖對植物乳桿菌的生長最有利，但卻沒有任何抑菌活性；D-木糖對植物乳桿菌的生長促進作用較小，但抑菌活性與對照比較接近，其原理有待進一步探討研究。

綜合植物乳桿菌生長和植物乳桿菌素的活性，確定D-果糖為最佳碳源。但考慮到經濟成本問題，將D-果糖與基本培養基中的葡萄糖作復配研究。

2.7 磷源對B-28生長及細菌素抑菌活性的影響

圖9為磷酸鹽對植物乳桿菌生長的影響；圖10為磷酸鹽對植物乳桿菌素抑菌活性的影響。由圖9和圖10可以看出，KH2PO4和NaH2PO4對植物乳桿菌B-28的生長和植物乳桿菌素抑菌活性的影響，與基本培養基相比，NaH2PO4作生長因子的培養基OD值略高一些；KH2PO4作生長因子的培養基，其植物乳桿菌素的抑菌活性略高，差異不明顯。因此確定磷源不采用新的磷酸鹽，因此確定采用原基本培養基中的K2HPO4。

2.8 優化培養基對細菌素活性的影響

將已經確定的最優氮源和碳源取代基本培養基中的氮源和碳源，以基本培養基為對照，其對植物乳桿菌素抑菌活性的影響結果如圖11所示。由圖11可以看出，其抑菌活性明顯高于對照，抑菌圈的直徑大約是對照的130%。因此，確定生產植物乳桿菌素的優化培養基配方（1 L）為：大豆蛋白胨15 g，酵母提取物5 g，D-果糖5 g，葡萄糖15 g，檸檬酸鈉2 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O為0.58g，MnSO4·4H2O為0.25 g，吐溫80為1 mL。

3 結論

（1）植物乳桿菌B28在37℃條件下培養，14～16 h，生長進入穩定期，pH值和菌數的變化滯后于OD值變化。植物乳桿菌B28產生細菌素的高峰期在培養發酵24 h。

（2）硫酸銨飽和度為70%時，是適植物乳桿菌細菌素的鹽析濃度。

（3）最佳成分優化后，植物乳桿菌抑菌活性提高了30%，植物乳桿菌B-28產植物乳桿菌素最佳培養基配方（1L）為：大豆蛋白胨15 g，酵母提取物5 g，D-果糖5 g，葡萄糖15 g，檸檬酸鈉2 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，MgSO4·7H2O為0.58 g，MnSO4·4H2O為0.25 g，吐溫80為1 mL。

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Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum B28

CHENG Jian-jun1，LI Xiang1，GUO Ming-ruo1，2，WU Qong1
（1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.University of Vermont，Burlington 05403，USA）

Lactobacillus plantarumB28，which is a strain isolated from traditional Bulgarian oat beverage，produces a bacteriocin which is inhibitory toBaeillus cereus.The growth characteristic ofLactobacillus plantarumB28and the optimal stage of producing bacteriocin were studied.The different cultures and different concentrations of ammonium sulphate effect on bacteriocin activity was observed.The growth cycle of B28was studied at 37℃which indicated its stationary phase starting from the 14 th hour to the 16th hour.The bacteriostatic activity of plantaricin, produced by the strain has been improving constantly.It reached the peak value at 24 h.L.Plantarumgrew better in media in presence of yeast extract,soybean protein,lactose,D-fructose,sucrose,or D-maltose.D-xylos was not suitalbe forL.Plantarum.There was no considerable effect when it grew in KH2PO4and NaH2PO4.The optimized medium was achieved.

Lactobacillus plantarum；Bacteriocin；medium

Q93-335

A

1001-2230（2011）04-0016-04

2011-01-21

程建軍（1969-），男，博士，從事農產品加工方面的研究。