酪蛋白水解物的Plastein反應修飾及ACE抑制活性變化

徐微，趙新淮

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

酪蛋白水解物的Plastein反應修飾及ACE抑制活性變化

徐微，趙新淮

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

采用中性蛋白酶水解酪蛋白，一定條件下制備水解度為13.0%、IC50質量濃度為40.4 mg/L的酪蛋白水解物。利用中性蛋白酶對所制備出的水解物進行plastein反應修飾，以反應體系的游離氨基量的變化為評價指標，通過單一因素試驗研究酶添加量、底物質量分數、反應時間和反應溫度對修飾反應的影響。結果表明，適宜的反應條件為中性蛋白酶添加量3 kU/g蛋白質、底物質量分數60%、反應時間6 h、反應溫度20℃。制備5個不同反應程度的修飾產物，ACE抑制活性分析結果顯示，修飾產物的IC50降至14.7～31.1 mg/L，表明中性蛋白酶催化的plastein反應修飾提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性，且ACE抑制活性的提高程度與plastein反應程度有關。

酪蛋白水解物；中性蛋白酶；plastein反應；ACE抑制活性

0 引言

血管緊張素I轉換酶（ACE）抑制肽是當前的研究熱點，例如已經從酪蛋白水解物中分離出的一個ACE抑制肽[1]。從食品蛋白質中獲得高活性ACE抑制肽，一般需要選擇水解條件[2-4]，或者是從水解物中分離、純化高活性的肽[5]。

Plastein反應是蛋白水解物在適宜的條件下經蛋白酶作用形成凝膠狀物質的反應[6]，反應機制涉及縮合作用、轉肽作用、物理聚集[7-9]，其中，轉肽作用和縮合作用涉及新肽鍵形成，縮合作用則涉及產物中游離氨基變化（即游離氨基量減少）。酪蛋白水解物的plastein反應修飾可以改善其ACE抑制活性[10-12]。因此，本研究利用中性蛋白酶水解酪蛋白，然后再采用中性蛋白酶進行plastein反應修飾酪蛋白水解物，研究一些反應條件對plastein反應的影響，并考察修飾反應最終對酪蛋白水解物ACE抑制活性的影響。

1 實驗

1.1 材料

酪蛋白（蛋白質質量分數為95.7%），中性蛋白酶，兔肺丙酮粉，FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly），卡托普利（Captopril），其他所有試劑均為分析純，所用水為超純水。

1.2 設備

UV-2401PC型紫外可見分光光度計，AL204型分析天平，Kjeltec TM2300型自動凱氏定氮儀，LGJ-1型真空冷凍干燥機，HZQ-F160型全溫振蕩培養箱，DELTA 320型精密pH計，H-1型微型漩渦混合器，YH-4BS型遠紅外恒溫干燥箱，DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白水解物的制備

配制質量分數10%的酪蛋白溶液，用濃度為2 mol/L的NaOH調節pH值至6.5，加入中性蛋白酶于45℃下進行水解，酶添加量為2 kU（每克蛋白質中）。于0，2，4，6，8，10，12 h分別取出溶液20 mL，迅速置于沸水浴中加熱15 min，冷卻后于5 000 r/min離心20 min，分離出上清液。測定上清液中蛋白質質量分數和游離氨基的量，計算其水解度，同時測定上清液的ACE抑制活性。通過以上分析，確定酪蛋白水解物的適宜制備條件，放大實驗，得到的上清液真空冷凍干燥后于-18℃保藏。

1.3.2 酪蛋白水解物的plastein反應修飾

用中性蛋白酶對酪蛋白水解產物進行plastein反應修飾。采用單因素實驗，分別考察酶添加量、底物濃度、溫度、時間對修飾反應的影響作用，以反應體系的游離氨基含量變化（底物游離氨基含量減去修飾產物游離氨基的量）為指標，選擇適宜的修飾反應條件。在反應結束后，所有的應樣品于沸水浴滅酶15 min，冷卻后測定游離氨基的量及其ACE抑制活性（以半數抑制濃度IC50表示）。

1.3.3 相關分析

1.3.3.1 蛋白質質量分數、水解度及蛋白酶活力測定

（1）蛋白質質量分數測定采用凱氏定氮法[13]。

（2）游離氨基的量及酪蛋白水解度測定采用鄰苯二甲醛（OPA）法[14，15]。

OPA試劑的配置：將2.0 g十二烷基磺酸鈉（SDS）加入到30 mL濃度為0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液（pH值為9.5），水浴加熱使其溶解，冷卻至室溫后再加入質量濃度為80 g/L的OPA乙醇溶液1mL、β-巰基乙醇200 μL，并用硼酸緩沖溶液定容至100 mL，此溶液現配現用。

游離氨基量的測定：配置系列亮氨酸標準溶液（0，6，12，15，20，24，30 g/L），取3 mL標準溶液與同體積的OPA試劑混合并開始計時，5 min后在340 nm波長下測定吸光值。以吸光值為橫坐標、亮氨酸質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。按照標準曲線制作步驟，測定分析樣品的吸光值，并根據標準曲線計算其游離氨基的量。

水解度（DH）的計算[16]如下：

式中：FA為樣品的游離氨基濃度；SN為樣品的氮質量濃度；0.6為酪蛋白的游離氨基濃度；8.2為酪蛋白的肽鍵濃度，6.38為蛋白質換算系數。

（3）蛋白酶活力采用福林酚法測定[17]。

1.3.3.2 ACE抑制活性

以FAPGG為底物，采用非連續分光光度法測定分析樣品的ACE抑制活性[18,19]。

ACE酶液：50 mg兔肺丙酮粉浸泡于5 mL預冷至4℃的硼酸緩沖溶液（pH值為8.3，濃度為100 mmol/L）中，4℃恒溫震蕩搖床中提取12 h后以20 000 r/min轉速冷凍離心20 min，分離出上清液并于4℃保存。

FAPGG底物溶液：將FAPGG溶于濃度為100 mmol/L的硼酸緩沖溶液（pH值為8.3，含濃度為300 mmol/L的NaCl），得濃度為1.6 mmol/L的溶液。

ACE抑制活性測定：500 μL FAPGG底物溶液與100 μL超純水或某一濃度的抑制劑（ACE抑制肽或卡托普利）混勻，37℃預熱2 min，加300 μL ACE酶液并在37℃反應30 min。立即加入100 μL EDTA（濃度為100 mmol/L）終止反應，加4.0 mL超純水稀釋，平行三次。0 min樣品測定需先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。340 nm下分別測定反應體系在0 min和30 min時的吸光值，計算差值ΔA（ΔA=A0min-A30min）。以單位時間內吸光值變化表示ACE酶活力，抑制劑對ACE酶的抑制程度為

式中：ΔAc為加入超純水時吸光值在30 min內的變化；ΔAi為加入抑制劑時吸光值在30 min內的變化。

IC50的計算：IC50定義為抑制50%ACE酶活力時抑制劑的濃度。配置不同濃度的ACE抑制劑，按以上步驟測定其ACE抑制活性。以抑制劑濃度的對數為橫坐標、ACE抑制活性為縱坐標，進行回歸分析；利用回歸方程計算抑制劑的半抑制濃度（IC50）。

2 結果與討論

2.1 酪蛋白水解物的制備

ACE抑制肽一般是由2～12個氨基酸殘基組成的小肽，C末端若為脯氨酸、芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp）等，則ACE抑制肽的活性一般較高[20-25]。酪蛋白含有豐富的脯氨酸和芳香族氨基酸，因此是酪蛋白水解物有較高的ACE抑制活性。利用中性蛋白酶水解酪蛋白至不同的時間，發現酪蛋白水解物的水解度及其相應ACE抑制活性的變化如圖1所示。圖1中，折線表示水解度；柱狀表示ACE抑制活性。

由圖1可以看出，酪蛋白水解產物的水解度隨反應時間的延長而增大，反應的初始階段（0～2 h），水解度變化較大，水解2 h時達到11.3%，隨后水解物的水解度隨反應時間緩慢增長，12 h時達到16.0%。未水解的酪蛋白（0 h）的ACE抑制活性很低（約2.4%），可能是由于酪蛋白在制備過程中被降解，也可能是污染了一些具有ACE抑制活性的小肽[26]。在酪蛋白水解的初始階段（0～4 h），酪蛋白水解產物對ACE的抑制活性隨水解度的增加而增大。當水解反應進行4 h以后，水解產物的ACE抑制活性增加不多。所以，選取水解時間為4 h的酪蛋白水解液進行以后的Plastein反應修飾，此水解物的水解度為13.0%，ACE抑制活性約為42.9%，所測定得到的IC50數值為（40.4±2.0）mg/L。

2.2 酪蛋白水解物的中性蛋白酶plastein反應修飾

在plastein反應過程中，縮合作用為其中的一個反應并導致游離氨基量減少，轉肽作用不引起游離氨基量變化。因此，可以用游離氨基量的變化作為衡量反應程度的一個指標。

2.2.1 酶添加量的影響

中性蛋白酶的適宜反應溫度為40℃左右。在底物質量分數為40%、反應時間為6 h時，考察酶添加量對修飾反應的影響，結果如圖2所示。圖2中，隨酶添加量的增加，反應體系中游離氨基的量變化增大，即plastein反應過程中發生縮合作用；在0.1～1 kU（每克蛋白質中）的酶添加量下，反應體系中游離氨基的量變化的增幅較大，1.0～5.0 kU/g范圍內，反應體系中游離氨基的量變化的增幅趨緩。考慮到反應速率及反應成本，選擇3 kU/g的酶添加量較為適宜。

2.2.2 底物質量分數的影響

底物質量分數對plastein反應的影響非常顯著；底物質量分數過低，水解反應占優勢；底物質量分數過高，反應體系黏度過大，不利于反應的發生。本研究選取底物質量分數為20%，30%，40%，50%，60%，研究底物對修飾反應的影響。選擇酶添加量為1 kU/g、溫度為30℃、反應時間為6 h。結果如圖3所示。由圖3可以看出，在質量分數為20%～60%的范圍內，隨著底物質量分數的增加，反應體系中游離氨基濃度變化很大，反應體系中縮合作用增加。所以，底物質量分數60%為適宜。

2.2.3 反應時間的影響

在底物質量分數為40%、酶添加量為1 kU/g、反應溫度為30℃的條件下，考查反應時間對plastein反應的影響，結果如圖4所示。由圖4可以看出，在初始階段（2～6 h），反應體系中游離氨基濃度變化的增加迅速，當反應時間為6 h時，反應體系中游離氨基量的變化達到142.74 μmol（每克蛋白質中），然后變化幅度減小。所以，適宜的反應時間為6 h。

2.2.4 反應溫度的影響

溫度對plastein反應具有雙重影響。熱力學上，plastein反應是一個放熱過程，升高溫度并不能增加反應產率；而低溫又不利于酶的催化作用，會導致反應速率下降。在底物質量分數為40%、酶添加量為1 kU/g蛋白質、反應時間為6 h時，反應溫度（10～50℃）對plastein反應的影響如圖5。在本實驗所選擇的溫度范圍內，溫度對plastein反應影響不太大。在40℃時酪蛋白水解物的游離氨基的量變化最大，達到143.77 μmol/g，而在10℃時則為最低，為115.90 μmol/g。綜合考慮，選擇接近室溫的20℃為適宜的反應溫度，此時游離氨基的量變化為134.82 μmol/g，與40℃時酪蛋白水解物的游離氨基的量變化接近。

整體上看，通過單一因素試驗，可以初步確定酪蛋白水解物進行plastein反應修飾時適宜反應條件為：中性蛋白酶添加量為3 kU/g、底物質量分數為60%、反應時間為6 h、反應溫度為20℃。通過中心組合試驗設計研究給出相似的結果（本文不給出具體的實驗結果），進一步確認單因素試驗所選擇的反應條件是適宜的。

2.3 plastein反應修飾后ACE抑制活性

在中性蛋白酶添加量為3 kU/g、底物質量分數為60%、反應溫度為20℃下，plastein反應修飾酪蛋白水解物，利用反應時間不同，分別制備出游離氨基含量變化呈現遞增趨勢的修飾產物5個。通過分析其ACE抑制活性，發現修飾產物的ACE活性均明顯的高于原始的酪蛋白水解物，如表1所示。整體的數值結果顯示，酪蛋白水解物經過plastein反應修飾后，相比原先的酪蛋白水解物（IC50為40.4 mg/L）其IC50數值范圍在14.7～31.1 mg/L，即ACE抑制活性提高。同時還可以看出，隨著反應體系游離氨基濃度變化的增大，修飾產物的ACE抑制活性隨之提高，這再次表明plastein反應修飾處理確實能夠有效地提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性，與過去的研究結果[10-12]相同。并且也可以看出，修飾產物ACE抑制活性的提高程度，初步顯示出與修飾反應的反應程度有關聯性，這一點也與過去的研究結果[10，11]一致。蛋白質水解物進行plastein反應修飾時，其ACE抑制活性為何改善的相關機制，還有待于進一步研究、揭示。

表1 酪蛋白水解物plastein反應修飾后的ACE抑制活性變化

3 結論

（1）利用中性蛋白酶對酪蛋白進行水解，在中性蛋白酶添加量為2 kU/g、pH值為6.5、45℃下水解10%酪蛋白溶液4 h，制備出有較高ACE抑制活性的酪蛋白水解物，其水解度為13.0%，ACE抑制活性為42.9%、IC50為（40.4±2.0）mg/L。

（2）利用中性蛋白酶對酪蛋白水解物進行修飾，通過單一因素試驗，并且比較反應體系中游離氨基量的變化，確定出適宜的反應條件為：中性蛋白酶添加量為3 kU/g、底物質量分數為60%、反應時間為6 h、反應溫度為20℃。

（3）利用上述的反應條件和不同的反應時間制備出5個酪蛋白水解物的修飾產物。ACE抑制活性評價結果顯示，修飾產物的IC50降低至14.7～31.1 mg/L，ACE抑制活性大幅度提高。研究結果再一次證明plastein修飾可以顯著改善蛋白質水解物的ACE抑制活性，并且ACE抑制活性的提高程度與plastein反應程度存在相關性。

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Modification of casein hydrolysates by plastein reaction and ACE inhibitory activity of the modified products

XU Wei ZHAO Xin-huai
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Casein was hydrolyzed by Neutrase under the fixed conditions to prepare casein hydrolysates that had the degree of hydrolysis of 13.0%and value of IC50about 40.4 μg/mL.The obtained hydrolysates then were modified by plastein reaction catalyzed by Neutrase.The effects of the addition level of Neutrase,the concentration of casein hydrolysates,reaction time and temperature on the plastein reaction of casein hydrolysates were studied by single factor experiments,with the decreased amount of free amino groups of the hydrolysates as the evaluation index.The results indicated that the suitable reaction conditions were addition level of Neutrase of 3 ku/g proteins,substrate concentration of 60%,reaction time of 6 h and reaction temperature of 20℃.Five modified casein hydrolysates were prepared with the selected reaction conditions but different reaction times.The analysis results showed that the modified hydrolysates had an improved ACE-inhibitory activity because their values of IC50ranged from 14.7 to 31.1μg/mL.Our results indicated that Neutrase-catalyzed plastein reaction could be applied to enhance the ACE-inhibitory activity of casein hydrolysates,and reaction extent of plastein reaction showed impact on the ACE-inhibitory activity of the modified product.

casein hydrolysates；Neutrase；plastein reaction；ACE inhibitory activity

Q93-33

A

1001-2230（2011）04-0008-04

2010-06-28

國家自然科學基金（30972132）；國家高技術發展計劃（863）（2006AA10Z324）。

徐微（1982-）女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

趙新淮