奶牛不同發育時期乳腺組織LAT1和4F2hc的表達

馮麗麗，林葉，李慶章

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

奶牛不同發育時期乳腺組織LAT1和4F2hc的表達

馮麗麗，林葉，李慶章

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

為研究氨基酸轉運載體LAT1的表達與奶牛乳腺發育的關系，應用免疫熒光技術和免疫印跡方法，檢測奶牛乳腺組織中LAT1及其輔助蛋白4F2hc表達的情況。結果表明，LAT1和4F2hc共表達于乳腺導管或腺泡的基底側和頂膜側；且泌乳期LAT1蛋白表達顯著高于其他發育時期，4F2hc蛋白表達量在圍產前期達到峰值，泌乳期4F2hc蛋白的表達量恢復至妊娠中期水平。結論：LAT1及4F2hc均特異性表達于不同發育時期奶牛乳腺組織中，提示LAT1參與了奶牛乳腺的發育和泌乳的調控。

奶牛；乳腺；LAT1；4F2hc

0 引言

哺乳動物細胞攝取的氨基酸需經多種氨基酸轉運載體介導[1]，LAT1是L型氨基酸轉運載體家族成員之一[2，3]，它是Na+非依賴型轉運載體，主要負責轉運疏水中性氨基酸。LAT1轉運功能的表達需要II型跨膜重鏈蛋白4F2hc的參與，它們在細胞膜上形成1個異二聚體[4]。在腦、腸、胎盤、睪丸和腫瘤細胞系等組織和細胞中都檢測到LAT1的表達[5-9]。奶牛乳腺是乳汁合成和分泌的器官，但是關于乳腺發育不同階段LAT1表達變化的研究卻鮮有報道。

本研究以奶牛為實驗對象，運用免疫印跡和免疫熒光的方法，研究奶牛不同發育階段乳腺中LAT1及4F2hc的表達情況，旨在揭示LAT1蛋白表達與奶牛乳腺發育與泌乳之間的關系，為探討乳腺發育提供基礎資料，為提高乳蛋白量奠定實驗基礎。

1 實驗

1.1 動物及取材

本研究選用36頭檢測無乳腺炎及其他疾病的荷斯坦奶牛作為實驗動物。

根據實驗需要采樣時間分為：青春期（12月、14月）；妊娠期（2月、4月、6月）；圍產前期（分娩前7日）；泌乳期（7日、50日、140日、280日）；干乳期（3日、30日），共4組12個時間點，每個采樣時間點選取3頭奶牛做平行實驗，每次試驗至少重復3次。飼養到預定取樣時間點，乳房中部消毒，按常規手術切取少量乳腺組織塊，獲取組織樣本。乳腺組織30 min內液氮速凍，保存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 試劑

兔抗LAT1多克隆抗體，鼠抗CD98單克隆抗體，鼠抗β-actin抗體，HRP標記的山羊抗兔IgG，HRP標記的雞抗鼠IgG，FITC-標記雞抗兔IgG和TRITC-標記羊抗鼠IgG，BCA蛋白濃度測定試劑盒，ECL超敏化學發光液，其他試劑為國產分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取及免疫印跡分析

將乳腺組織加入裂解液（濃度為50 mmol/L的Tris（pH值為7.4），濃度為150 mmol/L的NaCl，濃度為1 mmol/L的EDTA，體積分數為1%的TritonX-100，質量分數為1%的去氧膽酸鈉，質量分數為0.1%的SDS，質量分數為0.5%的NP40，濃度為1 mmol/L的PMSF）中，冰上機械勻漿。勻漿液10 000 g，4℃，離心5 min，取上清，即為總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，依說明書操作。

蛋白樣品調至等濃度與2×上樣緩沖液1︰1混合，95℃，煮沸5 min，上樣，40 μg/孔。8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分離，采用半干轉移電泳法將蛋白轉到硝酸纖維素膜（NC，Bio-Rad）上。將NC膜用質量濃度為50 g/L脫脂乳的TBST（濃度為50 mmol/L的Tris（pH值為8.0），質量分數為0.9%的NaCl，體積分數為0.05%的Tween20）緩沖液室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜。其中兔抗LAT1多克隆抗體1︰500稀釋、鼠抗CD98單克隆抗體1︰500稀釋、β-actin抗體1︰500稀釋。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，HRP-山羊抗兔IgG（1︰5 000），HRP-雞抗鼠IgG（1︰5 000）的二抗室溫孵育1.5 h，洗膜后用ECL超敏發光液示蹤。

1.3.2 數據分析

應用SPSS13.0統計軟件進行方差分析，所有試驗重復3次。定量數據以平均數（M）±標準差（SE）表示。3組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用Duncan檢驗。P＜0.05為統計學差異有顯著性。

1.3.3 免疫熒光組織化學

乳腺組織樣本離體后迅速制備冰凍切片，切片厚度為8 μm。冰凍切片置于4℃預冷的丙酮中固定10 min，PBS緩沖液（pH值為7.2）漂洗3次，質量分數為10%的正常羊血清室溫封閉1h，加入工作濃度的兔抗LAT1抗體（1︰50）和鼠抗CD98抗體（1︰50），4℃共孵育過夜，PBS緩沖液漂洗后，滴加FITC標記的雞抗兔IgG（1︰100）和TRITC標記羊抗鼠IgG（1︰100）室溫避光共孵育1 h，PBS緩沖液再次漂洗，DAPI（質量分數為10 mg/L）避光復染10 min，漂洗后，封片。實驗中用PBS代替一抗作為陰性對照。采用激光共聚焦顯微鏡對染色結果進行觀察。

2 結果

2.1 不同發育階段的相對表達量變化

圖1為奶牛乳腺不同發育時期LAT1和4F2hc蛋白的免疫印跡分析結果。圖1中，從左至右依次為：青春期12月和14月；妊娠期2月、4月、6月；圍產前期；泌乳期7日、50日、140日、280日；干乳期3日和30日；β-actin為內參蛋白。

圖2為奶牛乳腺不同發育時期LAT1和4F2hc蛋白的相對表達量。圖2中，橫坐標從左至右依次為：青春期12月和14月；妊娠期2月、4月、6月；圍產前期；泌乳期7日、50日、140日、280日；干乳期3日和30日。圖中無相同字母者表示乳腺不同發育時期差異顯著（P＜0.05），有相同字母者為差異不顯著（P＞0.05）。

LAT1和4F2hc抗體在發育不同階段均分別識別了相對分子質量大約50 ku和80 ku的蛋白條帶（圖1），表明LAT1和4F2hc蛋白在奶牛乳腺發育不同時期均有表達。采用光密度掃描方法得到奶牛乳腺不同發育時期LAT1和4F2hc表達的光密度值，并對其進行方差分析，結果如圖2所示。青春期、妊娠期和泌乳期LAT1的表達豐度整體呈遞增趨勢，干乳期急速下降，與其它發育階段相比泌乳期LAT1表達豐度最高，且顯著（P＜0.05）高于青春期、妊娠期、退化期，退化期顯著低于其它時期（P＜0.05），青春期和妊娠期整體水平差異不顯著（P＞0.05）。4F2hc蛋白的表達水平從青春期到妊娠期逐漸增加，圍產前期表達量達到峰值（P＜0.05），進入泌乳期4F2hc蛋白的表達量恢復至妊娠中期水平（P＞0.05），干乳初期與泌乳期4F2hc表達量無顯著變化（P＞0.05）。

2.2 不同發育階段的表達部位變化

圖3為奶牛乳腺不同發育時期LAT1和4F2hc的免疫熒光共定位。圖3中，每張切片隨機選擇包含有完整導管或腺泡結構的視野進行觀察，LAT1為綠色熒光（a），4F2hc為紅色熒光（b），細胞核為DAPI復染藍色熒光（c），兩者重疊為黃色或紅綠相間熒光（d）。A和B分別為青春期12月、14月；C～F分別為妊娠期2月、4月、6月，圍產前（7日）；G～J分別為泌乳7日、50日、140日、280日；K和L分別為干乳期3日和30日。M為PBS代替一抗作為陰性對照的免疫熒光結果，比例尺為75 μm。

圖3（I）～圖3（V）分別為青春期、妊娠期、泌乳期、干乳期、陰性對照的免疫熒光觀察結果。LAT1和4F2hc的免疫熒光染色主要沿著乳腺腺泡上皮細胞膜和導管的上皮細胞膜，且相對均一地分布在基底外側膜和頂膜上。

青春期腺泡上皮細胞很少，導管系統發達，LAT1和4F2hc的熒光染色主要沿著單層的小葉內導管（圖3A，B中箭頭）；妊娠期小葉內腺泡增多，腺泡芽逐漸發育成腺泡腔，LAT1和4F2hc的特異性熒光染色主要分布在導管上皮細胞和腺泡上皮細胞頂膜上，展示一個集中的線狀分布（圖3C～F中箭頭）；圍產前期頂膜和基底側均出現強烈的熒光染色（圖3F）；進入泌乳期，乳腺腺泡布滿乳腺內，LAT1和4F2hc的熒光染色圍繞整個腺泡，在基底側和頂膜均有分布（圖3G～J中箭頭）；干乳期乳腺腺泡逐漸退化，由于細胞凋亡的影響，乳腺腺泡上皮細胞排列雜亂無序且逐步減少，LAT1和4F2hc主要在基底側或圍繞退化的腺泡上皮細胞表達（圖3K和L中箭頭）。

3 討論

LAT1是L型氨基酸轉運系統的成員之一，它是一個Na+非依賴性氨基酸轉運體，主要負責轉運疏水大分子中性氨基酸，包括支鏈和芳香族氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸、蛋氨酸等[4,9]。牛的LAT1（SLC7A5）由SLC7A5基因編碼，其基因定位于牛的18號染色體，是具有12次跨膜域的膜蛋白，由505個氨基酸殘基組成，相對分子質量大約為54 980 u。為闡明氨基酸轉運體LAT1表達在奶牛乳腺發育中的意義，本實驗通過免疫熒光和免疫印跡（Westen blotting）的方法，研究了奶牛不同發育階段乳腺組織中性氨基酸轉運蛋白LAT1及其輔助蛋白4F2hc的表達情況。結果顯示，LAT1在奶牛乳腺發育的不同時期均有表達，但不同發育階段表達變化并不一致，揭示了LAT1蛋白參與了成年奶牛乳腺發育和泌乳的調控。本研究所得LAT1蛋白條帶分子量大小與預期略有差異，差異的產生可能與不同mRNA轉錄后調控或轉錄后修飾的不同、LAT1蛋白的糖蛋白特性、使用不同的細胞裂解液和SDS-PAGE上樣緩沖液有關。

乳腺從血液中攝取的氨基酸大部分用于合成乳蛋白，而不參與乳腺結構蛋白的構建[10]。泌乳期被攝取進入乳腺細胞內的氨基酸量增加，用以滿足如酪蛋白等乳蛋白的合成[11-12]。本研究結果顯示，奶牛在泌乳期，中性氨基酸轉運體LAT1表達顯著增加，這可能與細胞蛋白合成需要量的程度相關[13-14]。Finucane等[15]研究發現，牛泌乳期乳腺SLC7A5基因表達增加，Shennan和Gabriela等[16，17]在對小鼠乳腺中LAT1 mRNA定量時發現，LAT1 mRNA表達量在泌乳期顯著增高，妊娠期與青春期表達量無顯著差異。Rudolph等[18]在大鼠乳腺的研究中也發現，LAT1表達在泌乳期比妊娠期高，這些mRNA水平的定量結果與本研究對LAT1蛋白水平的定量結果基本一致。此外，Gabriela等[17]研究還顯示，與青春期鼠相比，陽離子氨基酸轉運體CAT1 mRNA豐度也在泌乳期間增加，與LAT1 mRNA表達趨勢平行。這可能部分解釋為，乳腺組織中大分子中性氨基酸與陽離子轉運體之間有某種相互作用，如LAT1的底物亮氨酸能刺激賴氨酸的流出等[19]。

泌乳期乳腺細胞在激素的刺激下增殖、分化，腺管腺泡發育，用于合成乳蛋白，LAT1作為可誘導型細胞膜蛋白，它能被激素、細胞因子等具有生物活性的分子誘導。激素含量大大增加的泌乳期，乳蛋白合成量增加，LAT1表達量也顯著上調，而非泌乳期相應的各種激素含量降低，乳蛋白量合成減少，LAT1表達也隨之下降。由于增加血液中胰島素的含量可降低血液中支鏈氨基酸的含量，提高乳蛋白的產量，Karensa等[20]通過用胰島素處理體外培養乳腺細胞，發現SLC7A5基因表達量也增加，說明乳蛋白合成量與SLC7A5基因表達量之間存在某種聯系。Bequette等[10]研究也表明，乳腺攝入的氨基酸除直接用于合成乳蛋白外，有一部分氨基酸參與合成其他功能物質、非必需氨基酸和支鏈氨基酸。在泌乳高峰期支鏈氨基酸（BCAAs）的氧化作用增加，一些與BCAA分解代謝有關的酶類被誘導以適應乳腺泌乳[21]。已有研究證明，亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸在乳腺內可被分解為有機酸、合成非必需氨基酸的碳架以及二氧化碳，更多BCAA的穿梭運動，尤其亮氨酸，增加原處新脂肪酸的合成，蛋氨酸參與磷脂、肉毒堿、肌肉素和多胺及半胱氨酸的合成[22]。這些研究說明，支鏈氨基酸（尤其是亮氨酸和異亮氨酸）不僅是合成機體蛋白質的原料，而且對蛋白質的合成有促進作用。這些氨基酸轉運進入泌乳乳腺，能支配不同乳成分合成底物的進入速率。作為它們進入乳腺的轉運媒介——L型氨基酸轉運蛋白1（LAT1）在奶產量高需求和乳蛋白積極合成的泌乳期表達豐度顯著增加說明LAT1在其中扮演重要角色。

鑒于LAT1介導的氨基酸轉運對于蛋白質的合成和細胞的生長、增殖的重要性，有必要對LAT1蛋白活性調節因子進行深入研究。目前，已有實驗通過定點突變、放射性氨基酸標記、細胞轉染等技術來確定LAT1蛋白在氨基酸轉運過程中的作用及結構，從而從根本上了解LAT1蛋白轉運氨基酸的機理。至于奶牛乳腺發育過程中LAT1的功能調節尚待進一步研究，LAT1是否是第一性的氨基酸轉運體也有待進一步確定。

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Expression of LAT1 and 4F2hc at different developmental stages in dairy cow mammary gland

FENG Li-li，LIN Ye，LI Qing-zhang
(The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To explore the relationship between expression of amino acid transporter LAT1 and development of dairy cow mammary gland，expression of LAT1 and auxiliary protein 4F2hc were detected using immune fluorescent technology and Western blotting method.Results showed that LAT1 and 4F2hc were co-expression in the basement membrane and the top side of mammary ductal or gland bubble epithelial cells;and LAT1 protein expression significantly increased at lactation than other development periods，then 4F2hc protein expression level was up to peak at perinatal，and lactation recovered to the middle of pregnant.Conclusion:LAT1 and 4F2hc were specific expression in different development stages of dairy cow mammary gland，indicated LAT1 played role in the development of mammary gland and regulation of lactation.

dairy cow；mammary gland；LAT1；4F2hc

TS252.1

A

1001-2230（2011）04-0004-04

2010-11-10

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2011CB100804）；東北農業大學創新團隊項目（CXT005-1-1）。

馮麗麗（1984-），女，碩士研究生，研究方向為乳腺發育與泌乳功能調控。

李慶章