神經生長因子、被動運動對失神經大鼠股骨生物力學性能的影響

王建民

(許昌學院體育學院，河南 許昌 461000)

神經生長因子、被動運動對失神經大鼠股骨生物力學性能的影響

王建民

(許昌學院體育學院，河南 許昌 461000)

目的:探討神經生長因子、被動運動對失神經大鼠股骨生物力學性能的影響。方法:去除坐骨神經和股神經造大鼠股骨廢用性骨質疏松模型，將大鼠隨機分為假手術組(SHAM組)、去神經對照組(DN組)、神經生長因子組(NGF組)、被動運動組(PM組)、神經生長因子+被動運動組(NGF+PM)組，觀察各組大鼠股骨生物力學指標的變化。結果:NGF+PM組股骨最大載荷、結構剛度、破斷載荷、最大應變、彈性模量、極限強度與DN組相比差異均具高度顯著性(P＜0.01);而與SHAM組相比差異不具顯著性(P＞0.05)，NGF組結構剛度、彈性模量、極限強度低于SHAM組 (P＜0.05)，最大載荷指標明顯低于SHAM組(P＜0.01);PM組最大載荷低于SHAM組(P＜0.05)，其余指標差異不顯著。結論:大鼠股骨失神經支配后骨生物力學性能下降，神經生長因子和被動運動均可減緩失神經大鼠股骨生物力學性能的改變，兩種方法合用能更有效防治大鼠失神經所致的廢用性骨質疏松。

神經生長因子;被動運動;廢用性骨質疏松;生物力學性能

神經性疾病所致癱瘓如脊髓損傷后的截癱或下肢癱、由于中風導致的偏癱或輕偏癱以及嚴重神經創傷受損后長期臥床，因失神經支配所致的廢用性骨質疏松發生率較高，表現為局部肢體失去神經支配和運動能力，目前尚無特效療法。開展防治失神經所致廢用性骨質疏松的研究，有助于減少并發癥，如病理性骨折、腎結石、關節周圍軟組織骨化、肢體畸形等［1］。本實驗采用大鼠失神經方法形成廢用性骨質疏松的動物模型，大鼠骨失神經支配后，主要表現為失神經支配和失運動能力兩個方面，本研究采用外源性神經生長因子和被動運動干預，通過檢測大鼠骨生物力學性能的變化，探討其對大鼠失神經所致廢用性骨質疏松的防治作用。

1 研究對象與方法

1.1 實驗對象

實驗動物(購于河南大學實驗動物中心)為3月齡健康雄性SD大鼠50只，體重 265.80±14.65 g，清潔級，在動物房中適應性喂養一周。標準嚙齒類動物飼料喂養，自由飲食。

1.2 研究方法

(1)實驗材料。

注射用鼠神經生長因子凍干粉(NGF，規格:20μg/支，每支含4500AU)，武漢海特生物制藥股份有限公司生產。骨鈣素試劑盒(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(TRACP)購自南京建成生物工程研究所。

(2)實驗分組。

將50只健康SD大鼠隨機分成A、B兩組，A組10只為假手術組(SHAM組)，B組40只為造模組，造模組大鼠行神經切除術。造模成功后，將B組40只大鼠隨機分成4組:去神經對照組(DN組);神經生長因子組(NGF組);被動運動組(PM組);神經生長因子加被動運動組(NGF+PM組)。每組10只，各組內依次編號并用不同顏色記號筆區分。

(3)造模方法。

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(25mg/kg)溶液麻醉，無菌條件下先于俯臥位行右后肢股外側切口，于股骨粗隆水平切斷坐骨神經，切除坐骨神經5－6mm，用生理鹽水沖洗并縫合切口;再置大鼠于仰臥位，正中縱切口，于腹股韌帶水平切斷大鼠右側股神經，切除股神經5－6mm并生理鹽水沖洗、縫合切口，縫合后切口消毒。A組進行同法操作，但不切斷神經。術后均給予慶大霉素切口外涂。

(4)治療方法。

治療于神經切除術后第4天進行，NGF組和NGF+PM組于手術側腓腸肌處按每公斤體重2個活性單位注射NGF，每天上午注射1次。其余組注射生理鹽水，各組大鼠隔日稱體重一次，并按體重變化給藥。PM組和NGF+PM組于注射30分鐘后進行被動運動。實驗時間為30天。

(5)被動運動方法［2］。

將大鼠置于自制的網夾內，拉出右后肢，抓住趾部，與脊柱呈45°向后外方牽拉，直至右后肢完全伸直(膝關節、踝關節均伸直)，然后再與牽拉方向相反，將右后肢推向身體，使之完全屈曲緊貼身體(膝關節完全屈曲，踝關節完全背屈)，這樣往復運動為1次，每天被動運動訓練300次。

(6)取材。

實驗30天后，各組在安靜狀態下稱重。所有動物均以股動脈放血處死，每組大鼠剝取右側股骨，剔除軟組織，用浸透生理鹽水的紗布包好，－20℃冰箱保存備用。

(7)股骨生物力學測試。

將股骨置于Instron萬能材料試驗機(美國Instron Co生產，型號:4302)上作三點彎曲實驗，加載速度為2mm/min，跨距為24mm，記錄其載荷－變形曲線和應力－應變曲線獲得。

(8)數據處理。

2 實驗結果

2.1 大鼠一般情況

手術后前兩天各組大鼠體重下降，進食減少，三天后各組大鼠體重開始增長，但DN組大鼠增長與其它組相比生長速度延緩，毛色光澤下降，有稀疏了蓬松感，活動力下降，神情倦怠。其他各去神經組手術后也有類似狀況，但隨著對其實施各種干預手段，毛色有所改善，活力增加，被動運動效果表現最好，大鼠體征與SHAM組類似，身體增長也較快。手術10天左右極個別大鼠出現自食現象，發現后剔出這些異常大鼠。各組大鼠實驗期間生長發育情況基本正常。

2.2 股骨生物力學性能的比較

(1)股骨結構力學參數的比較

見表2，在股骨最大載荷方面，DN和NGF組與SHAM組相比差異均具高度顯著性(P＜0.01)，PM組與SHAM差異具顯著性(P＜0.05)，NGF+PM組與SHAM組差異不具有顯著性(P＞0.05);SHAM、PM和NGF+PM與DN組間差異均具高度顯著性(P＜0.01)，NGF組與DN組間差異具顯著性(P＜0.05)。

在股骨斷裂載荷方面，與SHAM組相比DN組與之的差異具高度顯著性(P＜0.01)，其他組與之無顯著性差異(P＞0.05)。與DN組相比，SHAM、PM和NGF+PM與DN組間差異均具高度顯著性(P＜0.01)NGF組與DN組差異不具顯著性(P＞0.05)，但NGF組斷裂載荷明顯增加。

在股骨結構剛度方面，與SHAM相比，DN組與之的差異具高度顯著性(P＜0.01)，NGF組與之差異具顯著性(P＜0.05)，PM、NGF+PM組與之的差異無統計學意義(P＞0.05);SHAM、PM、NGF+PM與 DN組的差異具高度顯著性(P＜0.01)，NGF組與DN組差異具顯著性(P＜0.05)。

在能量吸收方面，除SHAM組和DN組間有顯著性 差異(P＜0.05)外，各組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 各組股骨結構力學參數的比較(±SD)

表2 各組股骨結構力學參數的比較(±SD)

注:與 SHAM組相比，▲:P＜0.05，▲▲:P＜0.01;與 DN 組相比，■:P＜0.05，■■:P＜0.01

組別 最大載荷(N) 斷裂載荷(N) 結構剛度(N·mm－1) 能量吸收(N·mm)SHAM 87.29 ±7.15■■ 54.88 ±10.34■■ 127.19 ±12.08■■ 63.54 ±4.08■61.03 ±4.15 DN 73.52 ±2.87▲▲ 40.42 ±6.50▲▲ 103.26 ±8.43▲▲ 54.40 ±7.57▲NGF 78.40 ±4.50▲▲■ 45.76 ±8.26■ 115.87 ±12.53▲■ 57.98 ±3.92 PM 81.33 ±3.42▲■■ 52.54 ±11.71■■ 119.27 ±6.81■■ 59.25 ±5.64 NGF+PM 85.51 ±2.77■■ 54.26 ±12.21■■ 123.45 ±12.15■■

(2)股骨材料力學參數的比較

由表3可以看出，在極限強度方面，DN組與SHAM組之間的差異具高度顯著性(P＜0.01)，NGF組與之差異具顯著性(P＜0.05)，其他兩組與之差異無統計學意義(P＞0.05);SHAM和 NGF+PM組與DN組比較差異具高度顯著性(P＜0.01)，PM組與之差異具顯著性(P＜0.05)，NGF組與之差異不顯著(P＞0.05)。

在最大應變方面，DN組與 SHAM組之間的差異具高度顯著性(P＜0.01)，其他各組與之比較差異不具統計學意義(P＞0.05);SHAM組、PM組和 NGF+PM組與DN組的差異均具有高度顯著性(P＜0.01)，NGF組與之差異則具顯著性(P＜0.05)。

在彈性模量方面，DN組與 SHAM組之間的差異具高度顯著性(P＜0.01)，其他各組與之差異不顯著(P＞0.05);SHAM組、NGF組、PM組和 NGF+PM組與DN組比較差一均具高度顯著性。

表3 各組股骨材料力學的比較(±SD)

表3 各組股骨材料力學的比較(±SD)

注:與 SHAM組相比，▲:P＜0.05，▲▲:P＜0.01;與 DN 組相比，■:P＜0.05，■■:P＜0.01

組別 極限強度(N mm－2) 最大應變(%) 彈性模量(MPa)SHAM 35.12 ±2.18■■ 2.55 ±0.67■■ 6870.89 ±608.27■■DN 27.41 ±2.23▲▲ 3.59 ±0.51▲▲ 5246 ±597.28▲▲NGF 28.89 ±2.04▲ 2.90 ±0.26■ 5728.36 ±501.66▲■PM 30.57 ±2.22■ 2.57 ±0.31■■ 6017.09 ±482.65■■NGF+PM 32.29 ±3.29■■ 2.66 ±0.36■■ 6416.34 ±438.29■■

3 討論

周圍神經損傷后，成骨細胞活性受到抑制，破骨作用加強，導致骨量減少和骨強度下降。

戴壽榮等［3］研究證明大鼠失神經支配后骨結構強度明顯下降。予以神經生長因子治療后，大鼠的骨小梁平均寬度、體積密度、連接點數均較失神經組有明顯增加，證明神經生長因子治療能明顯改善失神經后骨結構的改變，減少骨量的丟失。

本研究表明，大鼠股骨失去神經支配后，骨生物力學性能明顯下降。說明神經生長因子對去神經骨代謝具有重要的調節作用，可以預防去神經所致骨質疏松的的發生，其機制尚不清楚。

但一些研究［4］證實NGF對骨生成具有促進作用，內源性和外源性NGF可與成骨細胞LNGFR結合，使成骨能力增強。夏勝利等［5，6］研究表明人重組骨形態形成蛋白(rhBMP)可以誘導 NGF及其高親和受體(TrkA)的表達，表明 NGF間接或者直接通過 BMP路徑在最初骨的形成中發揮重要作用。NGF還可抑制骨吸收，通過抑制破骨細胞分泌酸性物質和基質金屬蛋白酶減少骨鈣吸收和骨膠原的降解作用，保持骨的機械性能和生物功能［7］。另外，神經生長因子具有控制神經元的存活，促進神經元的分化作用，通過修復神經來達到治療效果，NGF可引導神經長入骨痂，可促進P物質、降鈣素基因相關肽(CGRP)的釋放調節骨代謝［8］及促進骨組織對 1、25－(OH)2D3 提取過程［9］，并能通過增加交感神經的支配間接增加血管的生成，從而促進骨化等，本實驗也證實大鼠失神經支配后體重減少，失神經肌肉嚴重萎縮，而NGF可以延緩肌肉萎縮，維持肌肉對骨骼的應力作用，抑制骨吸收，有利于成骨。

運動對于骨骼的生長、再建和骨量的維持是一種機械刺激，較低或者完全喪失這種刺激對骨的作用，將誘導加速破骨細胞介導的骨吸收，并抑制成骨細胞介導的骨形成，從而導致骨丟失［10，11］。被動運動在臨床上是肢體關節康復的重要方法。被動運動能避免因固定所致的肌肉萎縮和廢用性骨質疏松等。本實驗表明，被動運動能夠抑制去神經大鼠骨生物力學性能的下降，延緩廢用性骨質疏松的發展?？赡軝C理為被動運動使失神經骨骼重新獲得應力刺激，增加骨內血流量，使成骨細胞活性升高，刺激骨形成，減少骨礦物質的損失，另外本實驗被動運動組大鼠肌肉萎縮不明顯，說明被動運動可以通過延緩肌肉的萎縮而間接對骨骼產生良性作用。

本實驗采用大鼠失神經方法形成廢用性骨質疏松的動物模型，大鼠骨失神經支配后，主要表現為失神經和失應力刺激兩個方面，針對性采用神經生長因子加被動運動同時進行治療，結果顯示兩種干預方法同時應用骨生物力學指標優于 PM組和 NGF組，接近SHAM組水平，延緩廢用性骨質疏松的發展效果顯著。可以初步推斷，神經生長因子療法和被動運動在調節骨代謝方面，兩者通過各自的作用途徑，既相互協同，又相互補充。NGF組和PM組大鼠體重均沒有出現明顯下降，肌肉萎縮不明顯，所以兩者在修復神經、延緩肌肉萎縮等方面作用是一致的，另外兩者相互聯系，被動運動可以促進內源性神經生長因子的釋放［12］，神經生長因子通過調節骨系細胞的活性，提高對應力刺激的感受性等等。雖從骨代謝指標來看，聯合療法優于單純一種干預方式，但目前對神經生長因子和被動運動方法預防廢用性骨質疏松機制的研究尚不全面，還有待進一步研究。

4 結論

(1)大鼠失神經支配后，骨生物力學性能下降明顯，神經生長因子和被動運動均能有效抑制這種變化，延緩去神經所致大鼠廢用性骨質疏松的發生。

(2)神經生長因子加被動運動組防治大鼠廢用性骨質疏松表現出更好的效果，具有協同作用。

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Effect of Exogenous Nerve Growth Factor and Passive Movement on Femoral Biomechanics of Denervated Rats

Wang Jian－Ming
(Sports Department，Xuchang University，Xuchang，Henan 461000)

Objective:to investigate the effect of exogenous nerve growth factor(NGF)and passive action on the biomechanics of denervated rats with disuse osteoporosis.Methods:rats were randomly divided into five groups(Sham group，DN group，NGF group，PMgroup and NGF+PMgroup).Results:compared with sham group，the biomechanical indices were in the denervation group(P＜ 0.01).The maximum load and modulus of elasticity in the combination group were both decreased(P ＜ 0.05).In the PM+NGF Group，the maximum load，structure stiffness and modulus of elasticity were all reduced(P ＜ 0.05).Conclusion:after the denervation，the muscular stress has been lost and femoral mechanical property decrease，nerve repair and regeneration will benefit to prevent or delay the appearance of osteoporosis.

exogenous nerve growth factor，passive movement，osteoporosis，muscular stress

G804.2

A

1001－9154(2011)06－0067－04

G804.2

A

1001－9154(2011)06－0067－04

王建民(1969—)，男，碩士，副教授;主要研究方向:高校體育教學與訓練。

2011－04－28