急性力竭運(yùn)動對青少年田徑運(yùn)動員血漿游離DNA的影響

王勇，傅博，朱榮39

（1.濰坊學(xué)院 體育學(xué)院，山東 濰坊 261061；2.遼寧省足球運(yùn)動管理中心，遼寧 沈陽 110081；3.溫州醫(yī)學(xué)院 體育科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

急性力竭運(yùn)動對青少年田徑運(yùn)動員血漿游離DNA的影響

王勇1，傅博2，朱榮329

（1.濰坊學(xué)院 體育學(xué)院，山東 濰坊 261061；2.遼寧省足球運(yùn)動管理中心，遼寧 沈陽 110081；3.溫州醫(yī)學(xué)院 體育科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

為探討急性力竭運(yùn)動對青少年田徑運(yùn)動員血漿游離DNA(cf-DNA)的影響，尋找運(yùn)動員機(jī)能監(jiān)控的新標(biāo)記物。安排16名青少年田徑運(yùn)動員在電動跑臺上進(jìn)行一次急性遞增負(fù)荷力竭運(yùn)動，于運(yùn)動前、運(yùn)動后即刻、運(yùn)動后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h和24 h分別測定紅細(xì)胞壓積(HCT)、cf-DNA、血漿丙二醛(MDA)、肌酸激酶(CK)和肌紅蛋白(Mb)。用心率表監(jiān)控運(yùn)動過程并記錄運(yùn)動時間和心率，推算訓(xùn)練沖量(TRIMPS)。結(jié)果顯示：HCT在所有監(jiān)測時間點均無顯著性變化(P>0.05)；cf-DNA在運(yùn)動后即刻顯著性升高(P<0.01)，30 min達(dá)峰值(P<0.01)，4 h后降至安靜水平(P>0.05)；血漿MDA、CK和Mb在運(yùn)動后即刻均顯著性升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)，并一直持續(xù)到運(yùn)動后24 h(P<0.01、P<0.05、P<0.01)。TRIMPS與運(yùn)動后15 min和30 min時cf-DNA水平呈顯著正相關(guān)(分別為r=0.55，P<0.01；r=0.64，P<0.05)。結(jié)果說明：cf-DNA是組織損傷早期標(biāo)志物，可作為運(yùn)動員機(jī)能監(jiān)控的新指標(biāo)。

運(yùn)動生物化學(xué)；力竭運(yùn)動；血漿游離DNA；機(jī)能監(jiān)控；運(yùn)動員

機(jī)能監(jiān)控是運(yùn)動訓(xùn)練的關(guān)鍵組成部分，是運(yùn)動員取得良好訓(xùn)練效果和優(yōu)異比賽成績的重要保障。科研人員和教練員不斷探索新的方法和標(biāo)記物，以便更科學(xué)地監(jiān)控運(yùn)動訓(xùn)練[1-2]。近年來，由于PCR及其相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可在體液中定量并分析含量極少的游離DNA，稱為循環(huán)DNA(circulation DNA)，即存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中的細(xì)胞外DNA，其中存在于血漿中的游離 DNA稱為血漿游離DNA(cell-free plasma DNA，cf-DNA)[3-4]。凋亡以及壞死細(xì)胞的DNA釋放入血即形成cf-DNA，它已成為臨床醫(yī)學(xué)中多種疾病(包括腫瘤、創(chuàng)傷、妊娠相關(guān)疾病、感染性疾病、心肌梗死等)早期診斷、病情監(jiān)測、療效及預(yù)后評估的一種重要的分子標(biāo)志物[3-4]。由于cf-DNA是一項無創(chuàng)性檢測指標(biāo)，因此有望在運(yùn)動醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。本研究旨在探討一次急性力竭運(yùn)動對青少年田徑運(yùn)動員cf-DNA的影響，同時將其與傳統(tǒng)機(jī)能監(jiān)控指標(biāo)丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌紅蛋白(myoglobin，Mb)進(jìn)行比較，以期尋找運(yùn)動員機(jī)能監(jiān)控的新的敏感標(biāo)記物。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

16名溫州體育運(yùn)動學(xué)校的男子田徑運(yùn)動員自愿參加本實驗，年齡(11.6±2.6)歲，身高(1.74±0.14) cm，體重(68.6±5.4) kg，訓(xùn)練年限(4.1±0.8)年。所有運(yùn)動員身體健康，無心血管疾病、急慢性感染、骨關(guān)節(jié)疾病及其他疾病史，無吸煙、飲酒等不良嗜好。

1.2 運(yùn)動方案

實驗前72 h內(nèi)受試者均未進(jìn)行過劇烈運(yùn)動，實驗前一晚至少睡眠8 h。清晨空腹采靜脈血5 mL后休息15 min，然后在電動跑臺上進(jìn)行遞增負(fù)荷實驗，起始負(fù)荷為5 km/h，持續(xù)3 min，之后每3 min遞增1 km/h，直至力竭。整個過程用遙測心率表(Polar，S810，芬蘭)記錄心率和運(yùn)動時間。運(yùn)動后即刻以及運(yùn)動后(休息) 15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、12 h和24 h靜脈采血5 mL，EDTA抗凝。

1.3 運(yùn)動負(fù)荷的量化——訓(xùn)練沖量(TRIMPS training impulses)

采用 Banister等[5-6]提出的計算運(yùn)動沖量的方法，公式為：運(yùn)動沖量=D×X×K。其中，D=運(yùn)動時間(min)，X=訓(xùn)練強(qiáng)度=(運(yùn)動時平均心率－安靜心率)/(最高心率－安靜心率)，K=訓(xùn)練強(qiáng)度加權(quán)指數(shù)=eαx(e為歐拉常數(shù)，是自然對數(shù)的底≈2.718 28；α=1.92)。

運(yùn)動時間、安靜心率、運(yùn)動時平均心率和最高心率均可通過心率表獲得。

1.4 MDA、CK和Mb的測定

取300 μL全血，測定HCT(紅細(xì)胞壓積)(全血分析儀，MICROS60，美國)；其余全血在低溫下(4 ℃)離心 15 min(3 000 r/min)，取血漿測試各生化指標(biāo)。MDA、CK和Mb使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)并嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，測試儀器：MD-100半自動生化分析儀(日本)。

1.5 cf-DNA的測定[7-8]

1)血漿DNA提取和純化。

取離心后的血漿400 μL，嚴(yán)格按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，德國)的操作步驟進(jìn)行cf-DNA的提取，然后用50 μL雙蒸水(不含RNA酶和DNA酶)進(jìn)行洗脫。

2)cf-DNA定量分析。

取10 μL cf-DNA置于透明載板，與1︰3 000熒光染料SYBR green I等比例稀釋并充分混勻后置于紫外及可見光成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)中，在激發(fā)光波長為345 nm、吸收波長500 nm條件下，讀取其發(fā)光強(qiáng)度。將檢測所得不同樣本DNA的發(fā)光強(qiáng)度代入根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)含量DNA的發(fā)光強(qiáng)度所作的回歸方程中，分別計算相應(yīng)的DNA質(zhì)量濃度。如果樣本發(fā)光強(qiáng)度超過標(biāo)準(zhǔn)DNA發(fā)光強(qiáng)度范圍，則將樣本稀釋后再進(jìn)行定量檢測，直到所測值在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)。每次對同一血漿樣本檢測3次，取其平均值，單位為pg/μL。

1.6 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，指標(biāo)各時間點的比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用Bonfferoni檢驗。對TRIMPS和cf-DNA進(jìn)行簡單相關(guān)分析并計算 Pearson相關(guān)系數(shù)?。P<0.05為顯著性水平，P<0.01為非常顯著水平。用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果及分析

2.1 各指標(biāo)的時程變化

HCT在所有監(jiān)測時間點均無顯著性變化(P>0.05)(圖 1)，因此，運(yùn)動干預(yù)與取血測試并沒有造成機(jī)體的明顯血漿丟失和血液濃縮，所有濃度指標(biāo)均可較為準(zhǔn)確反映其實際變化。

cf-DNA在運(yùn)動后即刻顯著性升高(P<0.01)，30 min達(dá)峰值(P<0.01)，隨后逐漸下降，運(yùn)動后3 h仍高于基礎(chǔ)水平(P<0.01)，運(yùn)動后4 h降至基礎(chǔ)值(P>0.05)，并一直維持到24 h(P>0.05)(圖2)。

MDA在運(yùn)動后即刻明顯升高(P<0.05)，隨后繼續(xù)升高，并在運(yùn)動后24 h出現(xiàn)峰值(P<0.01)(圖3)。

CK的變化與 MDA相似，即運(yùn)動后即刻升高(P<0.01)，運(yùn)動后24 h出現(xiàn)峰值(P<0.05)(圖4)。

Mb在運(yùn)動后即刻升高(P<0.01)，運(yùn)動后4 h出現(xiàn)峰值(P<0.05)，隨后逐漸下降，但在運(yùn)動后24 h仍高于基礎(chǔ)水平(P<0.01)(圖5)。

圖1 HCT在運(yùn)動前后的時程變化

圖2 cf-DNA在運(yùn)動前后的時程變化

圖3 MDA在運(yùn)動前后的時程變化

圖4 CK在運(yùn)動前后的時程變化

圖5 Mb在運(yùn)動前后的時程變化

2.2 相關(guān)分析

相關(guān)分析顯示，TRIMPS與運(yùn)動后15 min和30 min時cf-DNA水平呈顯著正相關(guān)(分別為r=0.55，P<0.01；r=0.64，P<0.05)。運(yùn)動之前與其他的時間點相關(guān)均無顯著性。

3 討論

劇烈運(yùn)動時肌肉暫時性缺血，運(yùn)動后恢復(fù)期血流再灌注(缺血-再灌注)，可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥細(xì)胞浸潤以及自由基產(chǎn)生增多，繼而發(fā)生DNA的氧化損傷和降解[9-10]。同時，運(yùn)動還通過機(jī)械作用造成肌纖維的損傷，表現(xiàn)為肌痛、無力、血清肌肉蛋白升高等。上述代謝機(jī)制和機(jī)械機(jī)制可導(dǎo)致肌細(xì)胞的凋亡甚至壞死[11]。本研究中MDA在運(yùn)動后顯著性升高，證實機(jī)體產(chǎn)生自由基增多；運(yùn)動后CK、Mb升高，表明肌細(xì)胞受到運(yùn)動誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷使其破壞增加[12]，其原因可能是自由基攻擊DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)(特別是膜的脂質(zhì)雙層)，從而產(chǎn)生氧化損傷所致[13]。DNA損傷(核苷酸氧化、雙鏈斷裂或DNA交聯(lián))后“事件”為DNA缺陷修復(fù)、凋亡和壞死[14-15]。DNA缺陷修復(fù)會造成DNA序列發(fā)生改變，引起代謝紊亂甚至癌癥[16]。非特異性DNA修復(fù)酶切除損傷部位并釋放DNA片段[17]，堿基特異性的修復(fù)酶切除相應(yīng)的堿基[18]，這些產(chǎn)物釋放入血形成cf-DNA。

cf-DNA最早發(fā)現(xiàn)于癌癥患者的血循環(huán)中[19]，隨后證實與多種臨床疾患相關(guān)聯(lián)。因此，cf-DNA已成為預(yù)測和診斷多種疾病的分子標(biāo)志物。例如，創(chuàng)傷后發(fā)生多器官功能紊亂綜合征的患者往往在創(chuàng)傷發(fā)生 15～30 min后cf-DNA即顯著升高，并持續(xù)數(shù)天；而無創(chuàng)傷并發(fā)癥的患者cf-DNA往往出現(xiàn)較晚、升高幅度較低、持續(xù)時間較短[20]。癌癥患者基因發(fā)生突變，血液中出現(xiàn)相應(yīng)的突變DNA、癌基因擴(kuò)增產(chǎn)物以及腫瘤相關(guān)的病毒DNA[21]。盡管cf-DNA與疾病關(guān)系的具體機(jī)制尚不明確，但諸多研究已證實，cf-DNA來自于凋亡或壞死的組織細(xì)胞[4]。在本研究中，力竭運(yùn)動后cf-DNA急劇增加同時伴隨血清CK與Mb升高，提示骨骼肌細(xì)胞凋亡、DNA片段的釋放可能是cf-DNA的主要來源，但不是唯一來源。一些研究表明，運(yùn)動后發(fā)生凋亡的腎小管細(xì)胞[22]和白細(xì)胞[23]均是cf-DNA的來源。因此，運(yùn)動后cf-DNA的升高是多種類型細(xì)胞凋亡的結(jié)果。

cf-DNA在運(yùn)動后的時程變化規(guī)律罕有報道。Atamaniuk等[23]觀察了一次力量訓(xùn)練對 cf-DNA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練后即刻cf-DNA顯著升高，2 h后顯著下降；Fatouros等對17名普通人進(jìn)行為期12周的力量訓(xùn)練干預(yù)，cf-DNA在訓(xùn)練后72 h仍高于安靜水平。這可能與不同的研究對象、運(yùn)動方式、運(yùn)動周期和測試時間等有關(guān)，但上述研究未檢測運(yùn)動后即刻至運(yùn)動后2 h這段時間內(nèi)cf-DNA的變化。

本研究以田徑運(yùn)動員為受試對象，采用力竭運(yùn)動模型，運(yùn)動后的測量時間點較為密集，從而揭示了cf-DNA在力竭運(yùn)動后的變化規(guī)律。cf-DNA在運(yùn)動后即刻顯著升高，30 min達(dá)峰值，隨后逐漸下降，運(yùn)動后3 h仍高于基礎(chǔ)水平，運(yùn)動后4 h降至基礎(chǔ)值，時間上比Atamaniuk等的研究結(jié)果稍滯后，可能與本研究所采用的力竭模型有關(guān)。cf-DNA在運(yùn)動后即迅速消除，這與傳統(tǒng)機(jī)能監(jiān)控指標(biāo)MDA、CK和Mb在運(yùn)動后顯著升高并一直持續(xù)到24 h的時程變化規(guī)律不同，可能與肝臟和腎臟對cf-DNA的快速代謝有關(guān)[4]，也可能是降解的 DNA片段從凋亡或壞死細(xì)胞釋放入血的機(jī)制不同[23]，具體原因尚不清楚。上述現(xiàn)象提示cf-DNA可能是監(jiān)測肌細(xì)胞損傷的早期、敏感、特異的預(yù)測與監(jiān)控指標(biāo)。

TRIMPS與cf-DNA正相關(guān)，說明cf-DNA除了可用于監(jiān)測身體機(jī)能狀態(tài)，還能反映訓(xùn)練負(fù)荷，即負(fù)荷越大，cf-DNA水平越高，可能是不同訓(xùn)練負(fù)荷造成機(jī)體損傷程度不同所致。Lo等[24]和Rainer等[25]分別證實了創(chuàng)傷與中風(fēng)患者組織損傷的程度與cf-DNA呈正相關(guān)關(guān)系，本研究在一定程度上也驗證了上述結(jié)論。TRIMPS與運(yùn)動后 30 min cf-DNA的相關(guān)系數(shù)最高(r=0.64)，而且cf-DNA在運(yùn)動后4 h迅速消退，提示訓(xùn)練后的測試時間是一個關(guān)鍵因素，因此用此指標(biāo)監(jiān)控訓(xùn)練負(fù)荷時，應(yīng)在運(yùn)動后30 min左右取血測定較為合理。

本研究探討了力竭運(yùn)動后cf-DNA的變化規(guī)律以及與訓(xùn)練負(fù)荷的關(guān)系，但仍有諸多問題尚未解決。今后的研究需要進(jìn)一步探討運(yùn)動誘導(dǎo)的cf-DNA的細(xì)胞來源和具體機(jī)制，不同運(yùn)動方式、不同競技項目以及不同機(jī)能狀態(tài)對cf-DNA的影響，揭示cf-DNA對運(yùn)動反應(yīng)和適應(yīng)的規(guī)律，從而為運(yùn)動員機(jī)能監(jiān)控提供敏感、無創(chuàng)的標(biāo)志物，為運(yùn)動員取得良好訓(xùn)練效果和優(yōu)異比賽成績提供科研保障。

cf-DNA是組織的損傷早期標(biāo)志物，可作為運(yùn)動員機(jī)能監(jiān)控的新指標(biāo)，但其時程變化規(guī)律不同于MDA、CK和Mb等傳統(tǒng)指標(biāo)。

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Effects of acute exhaustive exercising on cell-free plasma DNA of teenage track and field athletes

WANG Yong1，F(xiàn)U Bo2，ZHU Rong3
（1.School of Physical Education，Weifang University，Weifang 261061，China；2.Liaoning Center of Football Administration，Shenyang 110081，China；3.School of Physical Education，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China）

In order to probe into the effects of acute exhaustive exercising on cell-free plasma DNA of teenage track and field athletes, and to seek for a new marker for athlete performance monitoring, the authors arranged 16 teenage track and field athletes to do an acute exhaustive exercise on a power treadmill, tested their Hematocrit (HCT), Cf-DNA, plasma malondialdehyde (MDA), creatine kinase (CK) and myoglobin (Mb) respectively before exercising, immediately after exercising, at 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 12 h and 24 h after exercising, monitored the exercising process with a heat rate meter, recorded their exercising times and heart rates, calculated their exercising impulses (TRIMPS), and revealed the following findings: there was no significant change to HCT at all test times (P>0.05); cf-DNA increased significantly immediately after exercising (P<0.01), reached the peak value at 30 min (P<0.01), and lowered to the calm level at 4 h (P>0.05); plasma MDA, CK and Mb increased significantly immediately after exercising (P<0.05, P<0.01, P<0.01), and maintained up to 24 h after exercising (P<0.01, P<0.05, P<0.01); TRIMPS was positively correlative significantly with the cf-DNA level at 15 min and 30 min after exercising (r=0.55, P<0.01 and r=0.64, P<0.05 respectively). The said findings indicated that cf-DNA is an early marker for tissue damage, can be used as a new index for athlete performance monitoring.

sports biochemistry；exhaustive exercise；cell-free plasma DNA；performance monitoring；athlete

王勇（1979-），男，講師，碩士，研究方向：體育教育與健康。通訊作者：朱榮副教授。

G804.7

A

1006-7116(2011)05-0127-05

2011-01-25

浙江省教育廳科研計劃項目(Y201017123)。

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