茶藨生柱銹重寄生木霉粗毒素的基本性質

摘要：采用液體發酵和生物測定相結合的方法，研究了茶藨生柱銹(Cronartium ribicola)重寄生木霉SS003菌株（Trichoderma atroviride）所產粗毒素的基本性質。結果表明，SS003所產粗毒素為一類非蛋白質、極性較大的物質，具有較高的熱穩定性和酸堿穩定性，能被甲醇較好地提取出來，可被活性碳有效地吸附并為甲醇所洗脫。該結果為SS003菌株的活性成分研究及進一步開發利用奠定基礎。

關鍵詞：木霉；粗毒素;基本性質;茶藨生柱銹

中圖分類號：S432.4文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.02.004

Elementary Properties of Crude Toxin Produced by Mycoparasite (Trichoderma atroviride) of Cronartium ribicola

LI Yong-yan1， AO Xin-yu2， CHEN Yu-hui2

(1.Faculty of Conservation Biology， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650224， China; 2. Department of Fundamental Courses， Southwest Forestry University， Kunming ， Yunnan 650224， China)

Abstract：Adopting the methods of liquid culture and biologic detection， the elementary properties of crude toxin produced by mycoparasite (Trichoderma atroviride) SS003 of Cronartium ribicolawere studied. The results showed that the crude toxin produced by SS003 was a kind of non-protein material with higher polarity. The produced toxin ，which could be tolerant to high temperature and pH value variations，could be fully extracted by methanol， the toxin was effectively absorbed by the activated charcoal and be eluted by methanol. This result could lay the foundation for the active constituent research and further development usage of SS003 strain.

Key words: Trichoderma spp.; crude toxin; elementary property; Cronartium ribicola

茶藨生柱銹(Cronartium ribicola ) 是世界林木三大病害之一的五針松皰銹病的病原，在中國主要危害紅松（Pinus koraiensis）及華山松（P.armandii）[1-3]。據調查，茶藨生柱銹目前僅在云南已使上萬公頃華山松林發病[4-7]，嚴重威脅著長江上游防護林體系的建立，給生態恢復帶來極大困難。長期以來，對華山松皰銹病的治理以化學防治為主，并配以修枝、鏟除轉主寄主等營林技術措施。然而，由于茶藨生柱銹菌為長循環型轉主寄生銹菌，防治相當困難[6，8] 。

在華山松皰銹病防治研究過程中，從茶藨生柱銹菌銹孢子堆中分離獲得1株重寄生木霉SS003菌株（Trichoderma atroviride）。該菌株通過分泌毒素和胞壁降解酶破壞銹孢子，且生物學性狀優良，并具有良好的生防效果[9-11]。筆者對該菌株所產粗毒素的基本性質進行研究，為該菌的活性成分研究及進一步開發利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株為重寄生菌木霉SS003菌株，分離自茶藨生柱銹銹孢子堆[11]，由西南林業大學提供。生測材料為茶藨生柱銹菌的新鮮成熟銹孢子。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方法將供試菌株接于PDA培養基上擴繁5 d，然后用Φ=0.6 cm的打孔器在培養好的木霉平皿上打孔，將打好的菌塊接種在裝有100 mL Richard培養液的250 mL三角瓶中，每瓶接種3塊，以120 r·min-1振蕩培養 (25 ℃ ， L∶ D=12 ∶12)，培養液保持自然pH值。每處理重復3次。

1.2.2毒素原液的制備將培養8 d的供試菌株培養物，先用8 層紗布濾去菌絲體，所得的濾液經8 ℃，4 000 r·min-1離心20 min，上清液即為毒素原液。以上操作均在無菌條件下進行。濾液置于4 ℃下保存，備用。

1.2.3生測方法生測采用凹玻片法，即在滅過菌的凹玻片內注入100 μL毒素原液，取少量銹孢子浸于其中，適當攪拌使銹孢子與培養濾液充分接觸。蓋上蓋玻片后置于放有浸濕濾紙的培養皿內，室溫下定時觀察銹孢子的變化情況，每處理重復3次。按照楊艷紅[11]的方法判斷銹孢子的活力。

1.2.4毒素原液中蛋白與非蛋白部分的活性測定參照黃麗丹等[12]的方法進行。

1.2.5毒素在不同極性有機溶劑中的分配取相同體積的10份毒素原液，用旋轉蒸發儀于50 ℃下濃縮至小體積后，分別加入3倍體積不同極性的有機溶劑(甲醇、乙酸乙脂、氯仿、石油醚、苯、正丁醇、甲醇∶氯仿)，充分振蕩后靜置過夜，得溶劑相和殘留沉淀物（水相）。合并各萃取液于50 ℃下旋轉蒸發至干，沉淀物揮去殘留的溶劑，用蒸餾水恢復至原體積，取各部分進行生物測定，每處理重復3次。

1.2.6毒素粗提液的制備參照黃麗丹等[12]的方法進行。

1.2.7溫度對粗毒素活性的影響參照黃麗丹等[12]的方法并做一定改動。將毒素粗提液置于室溫0，50 ，100 ℃恒溫水浴鍋中和121 ℃、0.1 MP下處理30 min后，將各處理的毒素粗提液進行生物測定，每處理重復3次。

1.2.8 pH值對粗毒素活性的影響采用1 mol·L-1的HC1和NaOH分別調節毒素粗提液的pH 值（5.90）至3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，以未接菌的相應pH值的培養液作對照進行生物測定，每處理重復3次。

1.2.9活性碳對毒素粗提液中活性成分的吸附量取100 mL的毒素粗提液，加入3 g活性炭，用玻棒攪拌使其充分吸附，過濾后得濾液A；將吸附后的活性碳用100 mL蒸餾水洗脫并過濾，得濾液B (蒸餾水洗脫液)；再將已洗脫過的活性碳用甲醇洗脫后過濾得甲醇洗脫液， 然后將甲醇洗脫液于40 ℃下經旋轉蒸發除去甲醇，用蒸餾水恢復至100 mL得濾液C。將濾液A、B、C進行生物測定， 每處理重復3次。

2結果與分析

2.1毒素原液及其蛋白與非蛋白部分的活性

毒素原液中蛋白及非蛋白部分的生測結果見表1。表1顯示，SS003的毒素原液中蛋白質等大分子物質部分對銹孢子沒有傷害作用，而非蛋白部分基本保留了毒素原液的生物活性。

2.2毒素在不同極性有機溶劑中的分配

SS003的毒素粗提物經甲醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、苯、正丁醇等不同極性的有機溶劑萃取后進行生物測定，結果顯示，SS003所產毒素成分不溶于乙酸乙酯、氯仿、石油醚、苯、正丁醇等有機溶劑，僅部分溶于甲醇氯仿的混合溶劑中，而甲醇則能夠將毒素成分從水溶液中充分提取出來（表2）。因此，SS003所產的毒素是一類極性較大的物質。

2.3毒素原液中不同提取組分的生物活性

毒素原液經甲醇提取后，毒素粗提液（甲醇提取液）有明顯的生物活性，而蒸出液和甲醇提取殘留物水溶液對銹孢子基本無毒性（表3），該結果與用乙醇沉淀后非蛋白部分表現出的生物活性結果一致，表明用甲醇進行提取，毒素原液中絕大多數毒素物質可以被提取出來。

2.4溫度對粗毒素活性的影響

熱穩定性是毒素物質的基本性質之一。SS003的毒素粗提液在不同溫度處理下毒素生物活性均無明顯變化，具有很高的熱穩定性（表4）。

2.5pH值對粗毒素活性的影響

SS003所產毒素類物質在pH3.00~9.00范圍內具有一定的酸堿穩定性。不同pH值處理的毒素粗提液對銹孢子均有傷害作用，且傷害程度無明顯差異。而作為相應pH值的對照在試驗的范圍內對生測銹孢子均無傷害作用（表5），表明SS003對銹孢子的傷害作用是由所產毒素物質造成而不是由培養液的酸堿度引起的。

2.6活性碳對毒素粗提液中活性成分的吸附

采用活性碳處理SS003毒素粗提液，結果表明，毒素粗提液中的活性成分可被活性碳有效吸附，吸附后的活性成分不能被蒸餾水洗脫，但能為甲醇所洗脫。

3討論

（1）毒素原液經無水乙醇處理去掉蛋白、多糖及核酸等大分子物質后，非蛋白部分基本保留了毒素原液的活性，說明該菌產生的毒素是一類非蛋白質物質。從真菌復雜的代謝物中將毒素提取出來是一項比較困難的工作。用甲醇提取，經生測試驗結果表明，甲醇能夠將SS003菌株所產毒素充分提取，而蛋白質、核酸、多糖等大分子物質都不易溶于甲醇，易與毒素分開。且活性碳吸附試驗證明被吸附的毒素物質不能被蒸餾水洗脫但可為甲醇高效洗脫，進一步證實該菌產生的毒素是一類極性較大的物質。

(2)真菌毒素的穩定性是評價其利用價值的關鍵因素之一。從溫度、pH對粗毒素活性的影響來看，重寄生木霉SS003菌株產生的毒素是很穩定的。由于在自然條件下，重寄生菌的作用效果要受到環境條件等多因素的影響，防治效果不穩定。因此利用重寄生菌所產毒素進行生物防治應具有較高的開發利用價值。

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