高溫脅迫對(duì)海帶配子體生長和生理的影響

摘要：為研究海帶的高溫適應(yīng)機(jī)制，用不同的溫度(15，20，25，28，30 ℃)處理海帶配子體，觀察記錄配子體的生長狀態(tài)，并測(cè)定其葉綠素a、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量以及POD活性隨培養(yǎng)時(shí)間（1，3，5，7 d）的變化趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在20 ℃條件下，海帶配子體的生長和各項(xiàng)生理指標(biāo)與對(duì)照組15 ℃相比無明顯變化；在25 ℃條件下培養(yǎng)1 d后，除葉綠素a含量逐漸下降外，其余各項(xiàng)生理指標(biāo)均出現(xiàn)上升的趨勢(shì)；在28，30 ℃條件下，培養(yǎng)1 d后，葉綠素a含量明顯下降，細(xì)胞內(nèi)容物萎縮分離，顏色變淺，3 d后細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)一步萎縮，細(xì)胞膜破裂，5 d后細(xì)胞大量死亡 。

關(guān)鍵詞：海帶配子體；高溫脅迫；生長；生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)： S968.42+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.02.002

Effects of High Temperature Stress on Growth and Physiology of Gametophytes of Laminaria japonica

XUAN Hui， TONG Shao-ming， HOU He-sheng

(Key Laboratory of Plant Biotechnology in Liaoning Province，Institute of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning 116029，China)

Abstract：Some physiological indexes including the content of chlorophyll a，proline，soluble sugar，MDA and the activity of POD of the gametophytes of Laminaria japonica were measured under different temperatures(15，20，25，28，30 ℃) and different times(1，3，5，7 d).The results showed that all of the measured contents and activity of gametophytes of Laminaria japonica had little change under 20 ℃.When the gametophytes were cultured 1 day at 25 ℃， the contents of the physiological indexes ascended except for chlorophyll a.When the gametophytes were cultured 1 day under 28 ℃ and 30 ℃，the content of chlorophyll a descended obviously，the cellular contentshrunk and separated， the pigment of the cell faded， the cytomembrane was ruptured after 3 days， huge amounts of cells died after 5 days.

Key words: gametophytes of Laminaria japonica; high temperature stress; growth; physiological index

海帶（Laminaria japonica）在中國的養(yǎng)殖規(guī)模與產(chǎn)量均處于世界首位，養(yǎng)殖區(qū)域從中國北方沿海一直延伸至南方福建省沿海，其栽培面積也在不斷擴(kuò)大。隨著海洋污染和溫室效應(yīng)等環(huán)境條件的惡化，海帶養(yǎng)殖面臨著逐漸升高的溫度條件。海帶是冷水性藻類并以配子體形式渡過夏季高水溫期，因此，在實(shí)際育種生產(chǎn)中需要培育和篩選出耐高溫的新品種。目前，關(guān)于溫度對(duì)海帶配子體影響的報(bào)道主要集中在生長發(fā)育方面，曾呈奎[1]研究得出，海帶生長發(fā)育的最適溫度都在20 ℃以下；李曉捷[2]指出，在15 ℃條件下海帶配子體克隆生長速度最快，其致死溫度為25 ℃。除此以外，有關(guān)高溫對(duì)海帶配子體生長和生理的影響未見報(bào)道，其抵御高溫的機(jī)制亟待研究。本試驗(yàn)以海帶配子體為材料，在不同的高溫脅迫下觀察記錄其生長狀態(tài)，測(cè)定葉綠素a、脯氨酸、丙二醛、可溶性糖含量和POD活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，揭示海帶配子體受到高溫脅迫時(shí)，其生長狀態(tài)和細(xì)胞生理指標(biāo)的變化，為探討海帶配子體適應(yīng)高溫脅迫的生理變化提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料的培養(yǎng)與脅迫處理

海帶配子體系由大連水產(chǎn)學(xué)院張澤宇教授饋贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)室低溫弱光保種。為擴(kuò)大培養(yǎng)，將配子體接種到PES培養(yǎng)液中，在15 ℃、1 000 lx、14 h∶10 h光周期的培養(yǎng)箱中擴(kuò)繁，每隔7 d更換1次培養(yǎng)液。

設(shè)15，20，25，28，30 ℃ 5個(gè)處理組，以15 ℃為對(duì)照，分別在第1，3，5，7 天時(shí)用顯微鏡觀察并照相記錄其生長狀態(tài)，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，每個(gè)處理組合設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2生理指標(biāo)測(cè)定方法

葉綠素a含量測(cè)定采用乙醇法[3]；脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮法[3]；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮—硫酸比色法[4]；丙二醛含量測(cè)定采用三氯乙酸一硫代巴比妥酸法[3]；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1不同溫度下海帶配子體生長狀態(tài)的變化

如圖1所示，在15，20 ℃條件下，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，配子體呈淺褐色，細(xì)胞健康飽滿。在25 ℃條件下，處理1 d時(shí)，細(xì)胞有輕微萎縮。在28 ℃條件下，培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞內(nèi)容物萎縮分離；3 d后萎縮的細(xì)胞內(nèi)容物顏色變淺，部分藻體細(xì)胞膜破裂，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；5 d后細(xì)胞內(nèi)容物大量溢出，細(xì)胞大量死亡，7 d時(shí)，細(xì)胞全部死亡；在30 ℃條件下，培養(yǎng)1 d后，大量細(xì)胞內(nèi)容物萎縮，顏色變淺，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物溢出；3 d后藻體細(xì)胞全部死亡。配子體在28，30 ℃條件下，培養(yǎng)1 d后均見死亡現(xiàn)象，細(xì)胞死亡的數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增加。本試驗(yàn)結(jié)果與王梅林[5]描述的海帶配子體克隆在26 ℃條件下可正常存活、海帶雌配子因種類不同其致死溫度在22～28 ℃之間相似，海帶配子體在25 ℃條件下可正常存活7 d以上，在28，30 ℃條件下培養(yǎng)1 d后均見數(shù)量明顯的死亡細(xì)胞，5～7 d藻體細(xì)胞幾乎全部死亡。

2.2不同高溫脅迫下海帶配子體葉綠素a含量的變化

如圖2所示，與對(duì)照組15 ℃相比，在20 ℃條件下，處理1 d后葉綠素a含量下降，3 d后含量略上升，而后變化不大；在25℃條件下，葉綠素a含量逐漸下降；28，30 ℃處理1 d時(shí)，葉綠素a含量與對(duì)照組之間有顯著性差異(0.01

2.3 不同高溫脅迫下海帶配子體脯氨酸含量的變化

如圖3所示，在20 ℃和25 ℃條件下，脯氨酸含量逐漸上升；在28 ℃和30 ℃條件下，脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在培養(yǎng)1 d時(shí)，脯氨酸含量均達(dá)到最大值，與對(duì)照組差異顯著(0.01

2.4 不同高溫脅迫下海帶配子體可溶性糖含量的變化

如圖4所示，在20℃條件下，海帶配子體可溶性糖含量變化不明顯；25 ℃培養(yǎng)3 d時(shí)，可溶性糖含量上升達(dá)最大值，差異顯著(0.01

2.5 不同高溫脅迫下海帶配子體丙二醛含量的變化

如圖5所示，在高溫條件下，中國海帶配子體MDA含量逐漸上升，這是由于溫度升高對(duì)細(xì)胞造成氧化傷害并產(chǎn)生大量的氧自由基，細(xì)胞質(zhì)膜過氧化分解形成MDA[8]；在20 ℃條件下，細(xì)胞膜已經(jīng)受到一定程度的破壞，溫度越高，MDA的含量也越高，并且隨著脅迫時(shí)間的延長，MDA含量逐漸升高，這說明高溫對(duì)膜脂造成了不可逆的嚴(yán)重傷害。

2.6不同高溫脅迫下海帶配子體POD活性的變化

如圖6所示，在20 ℃和25 ℃條件下POD活性有所上升，POD能清除由于環(huán)境溫度升高細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基[9]； 28 ℃和30 ℃條件下，由于高溫對(duì)細(xì)胞的傷害太大，POD活性明顯下降，藻體細(xì)胞中的氧自由基不斷積累，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害甚至致死。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，環(huán)境溫度在20 ℃以上時(shí)，葉綠素a的響應(yīng)呈單一的下降趨勢(shì)；脯氨酸含量在20～25 ℃下逐漸上升，更高溫度（28～30 ℃）下先升高后降低；可溶性糖含量在20 ℃時(shí)逐漸上升，25 ℃下含量高于20 ℃，28 ℃和30 ℃下分別在第3天和第1天后出現(xiàn)明顯的下降，與配子體細(xì)胞遭到破壞相對(duì)應(yīng)；丙二醛含量在20 ℃下已經(jīng)有所上升，25 ℃下上升更加明顯，說明細(xì)胞膜在20 ℃時(shí)已經(jīng)遭到一定程度的降解，28 ℃和30 ℃條件下，由于配子體細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞和降解，丙二醛含量下降；POD活性在20 ℃和25 ℃下呈上升趨勢(shì)，而在28和30 ℃下則逐漸下降。上述變化說明，海帶配子體不能耐受25 ℃以上的高溫，當(dāng)溫度在20 ℃以上時(shí)，海帶配子體已經(jīng)處于脅迫條件下，海帶配子體適宜的培養(yǎng)溫度應(yīng)在20 ℃以下。

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