菠蘿微衛(wèi)星指紋圖譜的構(gòu)建

摘要：初步構(gòu)建了菠蘿種質(zhì)的SSR指紋圖譜，為菠蘿種質(zhì)鑒定提供了依據(jù)。從菠蘿EST－SSR開發(fā)的20對(duì)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增31份不同的菠蘿種質(zhì)，篩選出能夠穩(wěn)定擴(kuò)增且?guī)筒町惷黠@的SSR引物。挑選5對(duì)多態(tài)性高、分辨率高、重復(fù)性好的SSR引物對(duì)，作為標(biāo)準(zhǔn)引物對(duì)材料進(jìn)行擴(kuò)增。每對(duì)引物得到的多態(tài)性帶數(shù)8－15個(gè)，平均為11條；引物的多態(tài)信息含量(PIC)在0.6437-0.7928，平均0.7373。依據(jù)帶型特征，建立菠蘿DNA分子指紋圖譜。

關(guān)鍵詞：菠蘿；SSR；指紋圖譜

中圖分類號(hào)：S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)；1009-9980(2011)02-240-06

菠蘿屬菠蘿科、鳳梨屬，原產(chǎn)南美洲巴西和巴拉圭，在熱帶和亞熱帶地區(qū)均有分布。菠蘿最早由印第安人傳至中南美洲和西印度群島，自哥倫布從瓜德羅普島帶至西班牙之后，在世界各地推廣，覆蓋全球70多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。菠蘿在熱帶水果生產(chǎn)和貿(mào)易中的地位僅次于香蕉和芒果，是中南美洲和亞太地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。

在菠蘿的栽培及傳播過(guò)程中，由于傳播者及當(dāng)?shù)卦耘嗾叩牧?xí)慣命名不同，各品種的別名特別多，出現(xiàn)了異名或多名的現(xiàn)象，造成了菠蘿品種名稱混亂的現(xiàn)象，而且各大類群品種的變異性大，這不但阻礙了菠蘿種質(zhì)資源的合理利用，也影響了菠蘿的品種改良與育種。

DNA指紋圖譜是指建立在DNA標(biāo)記基礎(chǔ)上的某一品種所具有的區(qū)別于其他品種的特異DNA片段。DNA分子標(biāo)記繪制的品種指紋圖譜像人的指紋一樣具有個(gè)體特異性，能準(zhǔn)確、快速鑒定品種或品系，簡(jiǎn)化了作物育種和種子管理工作。通過(guò)圖譜可表現(xiàn)與目標(biāo)性狀有關(guān)的DNA水平的信息，避免了環(huán)境干擾；不受生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的制約；準(zhǔn)確可靠；特別適合從形態(tài)上較難鑒定的品種。通過(guò)檢測(cè)待測(cè)樣品是否具有目標(biāo)品種特有的指紋片段及其比例，可以有效地鑒定種子的純度、品種的真?zhèn)危瑢?duì)種子質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。另外，通過(guò)DNA指紋的比較可以方便地提供分子水平的直接證據(jù)，有利于品種或材料獲得專利保護(hù)。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記是近些年發(fā)展起來(lái)的建立在PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)上的分子遺傳標(biāo)記，已被廣泛用于玉米、水稻、大豆、小麥等農(nóng)作物DNA指紋圖譜的構(gòu)建及雜交種子純度鑒定研究中。國(guó)內(nèi)外有利用AFLP、ISSR、RAPD、RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)菠蘿進(jìn)行研究的報(bào)道，但SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用鮮見報(bào)道。

我們利用自主開發(fā)的5對(duì)SSR引物構(gòu)建了31份菠蘿種質(zhì)的SSR指紋圖譜，初步建立了一套適用于菠蘿種質(zhì)鑒定的SSR技術(shù)體系，旨在為菠蘿新品種的登記、分類和保護(hù)奠定分子基礎(chǔ)。

1、材料和方法

1.1材料

材料來(lái)源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所和中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，菠蘿種質(zhì)圃所保存的種質(zhì)(表1)。取田間生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲危害植株的幼嫩葉片，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

DNA提取采用改良的CTAB法，程序簡(jiǎn)介如下：取約1g樣品，在液氮中研磨成粉末；加5mLCTAB提取緩沖液[100mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)，5mmol·L^2--1EDTA-Na₂，0.35mol·L^-1葡萄糖，2％PVP40，用前加入3％β-巰基乙醇]，離心后棄去上清；加入5mL65℃預(yù)熱CTAB裂解緩沖液[100mmol·L^-1。Tris-HCl(pH8.0)，20mmol·L^-1EDTA-Na₂，1.4mol·L^-1NaCl，2％CTAB，2％PVP40，用前加入3％3-巰基乙醇]，搖勻，65℃水浴30-90min；加等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提；上清液用0.6倍體積的異丙醇和1/10體積3mol·L^-1乙酸鈉(pH5.2)沉淀DNA；用無(wú)離子水稀釋DNA之后用酚：氯仿：異戊醇(體積比為25：24：1)和氯仿：異戊醇(體積比為24：1)抽提純化；最后用2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA，用TE溶解。所有沉淀都經(jīng)70％乙醇清洗2-3次。

1.3PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20μL包括：2μL的10×PCR buffer，1.6μL的1.5mmol·L^-1MgCl₂，0.25mmol·L^-1dNTPs，5pmol正、反向引物各1μL，20ng模板DNA，0.15U Tag(5U·μL^-1)；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，30個(gè)循環(huán)(94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min)，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物的分離用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，1×TBE電泳緩沖液120V恒壓電泳1.5h，電泳完畢采用銀染顯色、檢測(cè)。觀察并照相記錄。

1.4指紋圖譜的構(gòu)建

借鑒小麥帶型記錄的新方法，根據(jù)每對(duì)SSR引物生成帶型間的差別直接對(duì)帶型進(jìn)行分類編號(hào)，可得到每個(gè)品種在相應(yīng)的引物擴(kuò)增時(shí)帶型編號(hào)，一個(gè)品種的DNA經(jīng)過(guò)不同引物擴(kuò)增后、將獲得一系列帶型編號(hào)，按照固定的引物順序，串聯(lián)各帶型編號(hào)形成一組數(shù)據(jù)，便是該品種的分子指紋圖譜。

2、結(jié)果與分析

2.1指紋圖譜

2.1.1SSR標(biāo)準(zhǔn)引物篩選應(yīng)用前期開發(fā)的20對(duì)菠蘿EST-SSR引物，篩選能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定帶型且不同材料之間差異明顯的SSR引物，從中選取5對(duì)多態(tài)性高、分辨率高、重復(fù)性好的SSR引物作為標(biāo)準(zhǔn)引物(表2)，用于構(gòu)建31份菠蘿材料的DNA指紋圖譜。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)帶譜的建立SSR帶型識(shí)別和記錄過(guò)程中，常因帶紋繁多、分布復(fù)雜而造成判讀和記錄困難。本試驗(yàn)借鑒小麥SSR帶型記錄的快捷方法——以帶型間的差別直接進(jìn)行編號(hào)，從而簡(jiǎn)化帶型的識(shí)別和記錄。該方法避免了由于錯(cuò)誤判斷引起的試驗(yàn)誤差，并可利用每個(gè)品種的帶型編號(hào)，建立品種(系)的DNA指紋。將5對(duì)引物依次用英文字母A，B，C，D，E表示，每對(duì)引物生成的有差別的帶型則用該引物的字母代號(hào)和一串阿拉伯?dāng)?shù)字組合記錄。5對(duì)引物EP-12，13，15，20和24按帶型差異可分別將31份供試材料分為6，7，7，7和6組，圖1所示為引物對(duì)EP-12的31份材料擴(kuò)增圖譜，圖2為引物對(duì)EP-12的標(biāo)準(zhǔn)帶型圖譜。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)圖譜的構(gòu)建將每對(duì)引物分別在31份種質(zhì)中擴(kuò)增出的帶型與該引物的標(biāo)準(zhǔn)帶譜進(jìn)行比較歸類，這樣每個(gè)品種將會(huì)有5個(gè)英文字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成的代碼，即是該品種的分子指紋圖譜(表3)。部分品種分子指紋圖譜見圖3。

2.2菠蘿材料的SSR分析

所篩選的5對(duì)引物均能夠在供試材料中擴(kuò)增出穩(wěn)定特異條帶，每對(duì)引物可以檢測(cè)到多態(tài)性條帶8－15個(gè)，平均11個(gè)，引物的多態(tài)信息含量(PIC)為0.6437-0.7928，平均0.7373。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物都不能單獨(dú)將所有供試材料完全區(qū)分開，只能將材料區(qū)分為6-7組。其中有4對(duì)引物在擴(kuò)增時(shí)具有特征帶譜；分別為EP-13的金菠蘿；EP-15的Puket、紅西班牙；EP-20的日本菠蘿、臺(tái)農(nóng)十八號(hào)、紅西班牙：EP-24的紅西班牙。

把5對(duì)引物分別進(jìn)行2對(duì)或3對(duì)組合后發(fā)現(xiàn)，任2對(duì)引物組合都不能將所有供試材料區(qū)分開。引物EP-13和EP-15引物組合后，發(fā)現(xiàn)能區(qū)分17份材料，加上EP-20后其余均能區(qū)分開。其他任意3對(duì)組合均不能將31份材料完全區(qū)分開。

3、討論

3.1菠蘿微衛(wèi)星指紋圖譜的初步建立

指紋圖譜的構(gòu)建采用了王立新等記錄小麥SSR帶型的方法，而不是傳統(tǒng)的用1和0數(shù)據(jù)記錄每條帶紋，此種方法的優(yōu)點(diǎn)是，一、適用于帶型種類多、每種帶型的帶紋數(shù)目多、帶紋分布不均勻的材料。二、它是針對(duì)每種帶型賦予不同的編號(hào)以示區(qū)別，在確定待測(cè)品種某SSR位點(diǎn)的帶型時(shí)，將待測(cè)品種的SSR帶型與該引物標(biāo)準(zhǔn)帶型可在同一塊膠上電泳，進(jìn)行比對(duì)，便可確定待測(cè)品種的帶型編號(hào)，增加引物數(shù)量或?qū)嶒?yàn)材料，有可能會(huì)增加不同的帶型，這樣可以繼續(xù)用英文字母和阿拉伯?dāng)?shù)字表示增加的引物和帶型，不影響以前記錄的結(jié)果，方便易行㈣。

3.2微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇

優(yōu)良品種是作物獲得高產(chǎn)的基礎(chǔ)，而品種混雜和純度降低會(huì)明顯降低產(chǎn)量，快速準(zhǔn)確地鑒定品種和進(jìn)行純度分析，對(duì)于種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、種性辨別、產(chǎn)權(quán)保護(hù)均有重要作用。種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系信息是育種工作的基礎(chǔ)，對(duì)優(yōu)良品種的遺傳多樣性進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)可以為親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢(shì)水平的預(yù)測(cè)提供預(yù)見性指導(dǎo)，這是育種目標(biāo)能否成功實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵。

目前菠蘿的分類方法仍存在一些問(wèn)題，如分類標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一、分類結(jié)果不一致；地區(qū)及國(guó)際間的種質(zhì)頻繁交流而導(dǎo)致同名異物、同物異名現(xiàn)象存在，造成了菠蘿品種名稱混亂的現(xiàn)象，而且各大類群品種的變異性大，這不但阻礙了菠蘿種質(zhì)資源的合理利用，也影響了菠蘿品種的改良與育種。關(guān)于菠蘿種質(zhì)分析的研究情況，在國(guó)外有少數(shù)應(yīng)用RFLP、RAPD對(duì)菠蘿種質(zhì)資源分類的報(bào)道，如M.F.Duval等應(yīng)用RFLP技術(shù)對(duì)菠蘿種質(zhì)資源進(jìn)行多樣性研究。有研究應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)18份菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了分子評(píng)價(jià)，得出供試菠蘿栽培種的相似系數(shù)在0.85以內(nèi)。Sergio feuser等應(yīng)用RAPD對(duì)菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了分子評(píng)價(jià)。而菠蘿SSR標(biāo)記的相關(guān)研究報(bào)道卻很少。

與其他標(biāo)記RAPD，RFLP及AFLP相比，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記在DNA指紋庫(kù)構(gòu)建上顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高；具有復(fù)等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物序列決定。便于不同實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開發(fā)引物，獲得的資料能夠在不同實(shí)驗(yàn)室重復(fù)并共享。

4、結(jié)論

利用微衛(wèi)星標(biāo)記，借鑒小麥SSR帶型記錄的快捷方法，構(gòu)建了31份菠蘿種質(zhì)的DNA指紋圖譜，初步建立了一套適用于菠蘿種質(zhì)鑒定的SSR技術(shù)體系，旨在為菠蘿新品種的登記、分類和保護(hù)奠定分子基礎(chǔ)。