基于IRAP技術的磨盤柿變異單株鑒定

摘要：以已知親子關系的柿品種、柿近緣種和磨盤柿標準品種為對照，對采自北京市房山區磨盤柿產區的部分變異單株進行了IRAP分析。結果表明，19條逆轉座子引物中的4個(rtdk13-f5，redk16-r10，rtdk4-p3和rtdk2-p6)可將供試11份變異單株完全區分；供試變異單株間的相似系數在0.90-0.98(平均0.94)，與磨盤柿標準品種的相似系數為0.91，大于種間和品種間相似系數，與芽變類型及其母株間的相似系數接近；聚類分析結果表明，變異單株與磨盤柿標準品種緊密相聚，分支模式與種間及品種間明顯有別。因此，供試11份變異單株已發生部分遺傳物質改變，且可能為磨盤柿芽變。IRAP可區分遺傳背景高度相似的種質間的微小變異，可望在果樹芽變鑒定中應用。

關鍵詞：柿；品種鑒定；親緣關系；芽變；逆轉座子分子標記；UPGMA

中圖分類號：S665.2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2011)02-257-06

植物基因組40％-60％為逆轉座子，其在縱向和橫向傳遞中能產生高度的異質性和拷貝數，且易被生物和非生物因素差異激活，成為植物遺傳多樣性的重要來源。基于逆轉座子的分子標記是檢測基因組變異的手段之一，尤其是Kalendar等開發的逆轉座子間擴增多態性(inter-retrotransposon amplifiedpotymorphism，IRAP)技術，操作簡單、多態性豐富、檢測效率高，已在種質鑒定、遺傳多樣性檢測和系統發育重建、基因作圖以及重要農藝性狀基因的標記等方面得到成功應用。

芽變是多年生木本果樹新品種選育的重要變異來源，許多主栽柿品種來自芽變。磨盤柿原產我國，分布最廣、面積最大，長期的營養繁殖可能已經積累許多變異類型，但早期采用的形態學鑒定由于環境條件和技術人員的主觀因素等原因往往影響鑒定結果的真實性。常規分子標記一般難以準確鑒定芽變單株。基于逆轉座子的分子標記技術可能對變異微小的單株鑒別更為有效。因此，我們對北京市房山區磨盤柿產區的系列變異單株進行IRAP分析，以期為明晰其變異性質提供科學依據。

1、材料和方法

1.1材料

供試材料共20個基因型。包括柿的近緣種君遷子(Diospyros lotus L.)、已知親子關系的若干柿品種、磨盤柿標準品種(D.kaki cv.Damopan)及其11個變異單株。試材采集地及詳細信息見表1。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取和質量檢測參考Doyle等的方法。DNA質量及濃度檢測使用Cary-50紫外分光光度計(美國Varian公司)，終質量濃度稀釋至10mg·L^-1，4℃保存備用。

1.2.2IRAP擴增及產物檢測IRAP操作同杜曉云等。逆轉座子引物序列見表2(參考杜曉云等和Du等)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增產物于2.0％瓊脂糖(西班牙Biowest)凝膠電泳檢測。SYNGENE凝膠成像系統觀察和記錄譜帶。

1.2.3擴增譜帶統計分析電泳條帶按1/0形式進行數據轉換，只統計清晰、重復性強的條帶。擴增產物按同一位點條帶有或無分別賦值，有帶記為“1”，無帶記為“0”；采用NTSYS-pe version 2.1軟件計算Jaccard相似系數，UPGMA(unweighted pair groupmethod arithmetic averages)法聚類。

2、結果與分析

2.1多態性分析

19個逆轉座子引物在供試的20份試材中共擴增出123條帶，其中51.22％(63條)具多態性。19個引物中，8個無多態性，其他11個引物的多態性介于50.00％-90.00％。利用該11個引物可將20份試材全部區分。19個逆轉座子引物的詳細擴增情況見表3。

供試12份磨盤柿中，19個引物共擴增109條帶，多態性帶21條，多態比例19.27％。其中，4個引物(rtdk4-p3，rtdk2-p6，rtdkl3-f5和rtdkl6-r10)具多態性。利用多態引物能很好地對12份磨盤柿基因型鑒別區分(表4)。圖1箭頭所指為可用于鑒別某些基因型的特異譜帶。

2.2相似系數及聚類分析

基于19個引物的123個IRAP標記計算試材間相似系數。作為外類群的柿近緣種君遷子與柿的平均相似系數為0.68；已知親子關系的陽豐與其母本富有和父本次郎間的平均相似系數分別為0.85和0.87；已知芽變關系的前川次郎(次郎的芽變)和次郎，富有和松本早生(富有的芽變)，松本早生和上西早生(松本早生的芽變)、富有和上西早生間的相似系數依次為0.97、0.96、0.90和0.88。11份磨盤柿變異單株間的相似系數在0.90(DMP2與DMP4、DMP8、DMP9)-0.98(DMP7和DMP8)之間，平均0.94，它們與標準品種BZDMP平均相似系數為0.91。可見，供試變異單株與標準品種間的差異可歸屬于芽變范圍。

由UPGMA聚類所得的樹狀圖(圖2)可見，在相似系數0.92水平上，12份磨盤柿基因型緊密相聚，之后與同為中國原產的完全甜柿品種一羅田甜柿相聚形成Clusterl。供試日本原產柿品種相聚為Cluster2，且次郎與其芽變前川次郎直接相聚，然后與其子代陽豐聚為一支；富有與其芽變松本早生先相聚，再與松本早生芽變上西早生聚為一支。君遷子作為外類群，與柿(Clusterl、Cluster2)明顯分開，形成單獨一支。

3、討論

北京市房山區林業局在成熟期、果實形態、耐貯性及植株抗性等方面的調查結果初步表明，供試變異單株與磨盤柿有別，且性狀表現基本穩定(數據未發表)。本試驗通過逆轉座子分子標記技術，檢測到它們與標準品種間存在不同程度的遺傳差異，表明其遺傳物質已發生改變，并非飾變。這些變異單株的發現和鑒定可為磨盤柿芽變新品種選育提供理論依據。

本試驗試材代表了柿屬不同程度的變異，包括種間、種下品種間、親本與子代間，以及直接芽變和間接芽變品種的變異。君遷子與柿的親緣關系較遠，二者間平均相似系數0.68；不同柿品種問的平均相似系數低于0.89；芽變品種間的平均相似系數大于0.89。供試的11個變異單株與其標準品種間的平均相似性為0.91，大于種間和普通品種問的相似水平，與芽變品種間的相似水平接近；從聚類圖上看，變異單株間及其與標準品種間的分支模式也與種間和普通品種間明顯不同，結合DNA分析結果和形態學特征可初步判斷供試變異單株應該屬于磨盤柿的芽變。

逆轉座子變異可能是植物芽變的機制之一，本研究結果也表明逆轉座子可能參與了柿芽變的形成，而不同試材間的相似系數的差異。可能反映基因組變異的部分細節。如前川次郎和次郎、富有和松本早生、DMP2和BZDMP以及DMP10和DMP7、DMP8間。可能表明逆轉座子插入只涉及很少位點或少數基因的突變；如富有和上西早生，DMP3、DMP10、DMP11和BZDMP間則可能涉及基因組中較大的結構變化，包括染色體畸變以及由此所致的基因或DNA分子的線性順序變化。